冷诱导RNA结合蛋白促进冷冻保存大鼠坐骨神经异体移植后神经再生的研究

来源 :重庆医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:jianxiangqiao
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目的:  探讨冷诱导RNA结合蛋白(cold-inducible RNA binding protein,CIRP)对冷冻保存大鼠坐骨神经活性及同种异体移植后神经再生的影响。  方法:  176条15 mm雄性SD大鼠坐骨神经片段置于DMEM溶液中,分别在4℃、15℃、32℃预处理24 h(A组:4℃组,B组:15℃组,C组:32℃组),设置新鲜神经对照组(D组),Real-time PCR和Western blot检测CIRP基因及蛋白表达。将上述四组神经置于冷冻保存液中液氮保存4周,钙黄绿素/碘化丙啶(Calcein-AM/propidium iodide, Calcein-AM/PI)荧光染色、激光共聚焦显微镜观察保存后神经活细胞、死细胞情况,Western blot检测Bax、Bcl-2蛋白表达。取冷冻保存4周的坐骨神经,于37℃、5% CO2孵箱中培养7天,Western blot检测NGF、GDNF蛋白表达。用冷冻保存4周或新鲜雄性SD大鼠坐骨神经(E组:新鲜神经组),修复对应的雄性Wistar大鼠坐骨神经10 mm缺损(A′:同种异体移植4℃组、B′:同种异体移植15℃组、C′:同种异体移植32℃组、D′:同种异体移植对照组、E′组:新鲜神经同种异体移植组),设立同系移植新鲜组(F′组)。术后4周,免疫组化染色观察移植段神经CD4+T淋巴细胞入侵,ELISA检测血清IL-6、IFN-γ水平;术后20周,电生理检测肌肉复合动作电位(compound muscle action potential,CMAP)和运动神经传导速度(motor nerve conduction velocity,MNCV),甲苯胺蓝染色分析再生有髓神经纤维数目和髓鞘厚度,电镜观察再生神经超微结构。  结果:  C组神经CIRP mRNA及蛋白表达均显著高于A、B组(P<0.05)。冷冻保存4周后,与A、B、D组相比,C组神经活细胞数量较多,Bax表达降低,Bcl-2表达升高;冷冻保存神经NGF、GDNF表达,C组均显著高于A、B组(P<0.05)。同种异体移植术后4周,CD4+ T淋巴细胞入侵和血清IL-6、IFN-γ水平,与E′组相比,C′组显著降低且具有统计学差异(P<0.05),但C′组与D′、F′组比较无统计学差异(P>0.05)。术后20周,C′组CMAP、MNCV、再生神经轴突密度及髓鞘厚度均显著优于A′、B′、D′组及E′组(P<0.05),与F′组相近;再生神经超微结构显示,与A′、B′、D′组及E′组相比,C′、F′组有髓神经纤维数量多,纤维粗细均匀,分布广泛、髓鞘厚。  结论:  在32℃预处理可促进坐骨神经CIRP高表达,CIRP高表达对冷冻保存大鼠坐骨神经具有保护作用,能维持保存后神经的生物活性,促进同种异体移植后受体神经再生。
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