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甾体药物作为仅次于抗生素第二大类药物,在日常生活中具有很广泛的应用。雄甾-4-烯-3,17-二酮(androst-4-end-3,17-dione, AD)和雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(androst-1,4-end-3,17-dione, ADD)是微生物转化植物甾醇过程中的重要产物,是重要的甾体药物中间体,可以作为合成甾体药物的前体物质。3-甾酮-△’-脱氢酶(KSDD)是微生物转化植物甾醇过程中的关键酶,对AD(D)合成有重要影响。本实验室保藏了一株能够转化植物甾醇为AD(D)的新金色分枝杆菌((Mycobacterium neoaurum),因此以该菌为基础从多个方面对KSDD的性质和功能进行了研究。首先克隆了该菌株KSDD编码基因ksdD的1.7 kb全序列,连接pET-28a表达载体后在大肠杆菌E. coli BL21中诱导表达,但是表达出的KSDD酶蛋白以无活性的包涵体形式存在。通过优化诱导条件,降低蛋白表达量,KSDD重组蛋白仍然以包涵体形式存在。为了验证ksdD基因在分枝杆菌中的功能,利用PCR方法扩增出pET-28a质粒上1.4kb的卡那霉素抗性基因Km,构建了非复制型整合载体pMD18-T-ksdD::Km用于敲除ksdD基因。电击转化分枝杆菌M. neoaurum JC-12,经过表型和基因型验证,证实了原始菌株M. neoaurum JC-12中ksdD基因缺失。对菌株生长曲线测定显示,ksdD基因缺失对重组菌生长无影响；酶活检测显示重组菌KSDD酶活为15.6 mU/mg,与原始菌株相比下降了85%；甾醇转化实验发现重组菌AD产量为0.336 g/L,与原始菌株相比提升了1倍。为了实现ksdD基因在分枝杆菌M. neoaurum中的过量表达,将ksdD基因置于卡那霉素抗性基因启动子Pkan下游,并利用该菌的16S rDNA序列作为整合区域,构建了载体pETPkan-ksdD-16SrDNA。电击转化分枝杆菌M. neoaurum JC-12,经过表型和基因型验证,证实了Pkan-ksdD表达序列成功整合至原始菌株染色体上。对菌株生长曲线测定显示,ksdD基因过量表达对重组菌生长无影响；酶活检测显示重组菌KSDD酶活为157.3 mU/mg,与原始菌株相比提升了42.4%；甾醇转化实验发现重组菌ADD产量为1.246 g/L,与原始菌株相比提升了24.8%。以上结果说明KSDD是AD合成ADD过程中的关键酶,为今后进一步研究奠定了基础。