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前言阻塞性睡眠呼吸暂停综合征(obstructive sleep apnea,OSA)是一种十分普遍但并未被全面认识的疾病,对各个年龄段的患者均可带来心血管及神经系统的健康危害。其发作时由于频繁的呼吸暂停和上呼吸道部分或完全阻塞导致睡眠时反复发生间歇性低氧血症、高碳酸血症,微觉醒或觉醒,扰乱睡眠结构[1]。近年来,阻塞性睡眠呼吸暂停综合征的患者经常被报道出现认知损害[2-4]。这种认知障碍与相关大脑区域的损伤密切相关,尤其是海马,在间歇性缺氧产生(intermittent hypoxi,IH)过量的一系列活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)[5]的介导下可能发生细胞凋亡,引起空间记忆和学习受损[6]。OSA患者经常伴随着orexin-A水平的增加[7,8]。Orexin是一种多功能兴奋性神经肽,通过激活 orexin-1 受体(orexin receptor 1,OX1R)和 orexin-2 受体(orexin receptor 2,OX2R)来发挥多种生理功能的调节作用,如睡眠-觉醒的调节。此外,Orexin系统还参与海马等与学习记忆功能相关脑区的功能活动。虽然进行了诸多研究OSA与认知障碍的相关研究,但是,目前OSA引起认知功能损害的确切机制尚不完全明确。本实验拟从体外观察orexin-A对间歇性缺氧状态下海马神经元的作用,并进一步探究其潜在作用通路及分子机制。目的建立大鼠海马神经元间歇性缺氧模型,利用检测细胞凋亡率评价orexin-A对缺氧状态下海马神经元的影响。首先,利用Western blot检测p-ERK1/2的表达,以明确orexin-A诱导ERK1/2磷酸化加重了缺氧状态下海马神经元的损伤,并采用MEK阻滞剂U0126抑制ERK1/2通路以进一步验证;其次,利用siRNA技术分别沉默PLC β 1和PLC β 4,以明确在引起ERK1/2活化的orexin-A-OXlR/OX2R-Gq-PLC-/PKC信号通路中具体是哪一个PLC亚单位参与。方法1.急性分离出生24h内的Wistar大鼠海马组织,用胰蛋白酶消化与机械吹打相结合的方法分离海马神经元进行原代细胞培养。培养过程中观察神经元的形态学特征,并采用免疫细胞化学技术,用神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)抗体鉴定神经元纯度。2.培养4d的大鼠海马神经元用于实验研究,放入三气培养箱中,缺氧(1%02,5%CO2 和 94%N2)5min 复氧(21%O2,5%CO2 和 74%N2)1Omin,共进行 64 次循环;orexin-A处理组海马神经元在给予间歇性缺氧后,加入orexin-A使其终浓度分别为1nM,3nM,1OnM和100nM。继续培养48h后,收集各组细胞Annexin V-FITC/PI双染后入流式细胞仪进行细胞凋亡率检测。3.将体外培养4d的大鼠海马神经元随机分为对照组、IH组、IH+orexin-A(100Nm/L)组和 IH+orexin-A(100Nm/L)+U0126 组,干预处理后继续培养 48h,提取各组海马神经元总蛋白,采用Western blot法检测p-ERK1/2的表达。4.将体外培养4d的大鼠海马神经元随机分为对照组、IH组、IH+orexin-A(100Nm/L)组和 IH+orexin-A(100Nm/L)+U0126 组,干预处理后继续培养 48h,收集各组细胞Annexin V-FITC/PI双染后入流式细胞仪进行细胞凋亡率检测。5.将体外培养4d的大鼠海马神经元随机分为control siRNA(-)组、control siRNA(+)组、siRNA-PLCβ1(-)组、siRNA-PLCβ1(+)组、siRNA-PLCβ 4(-)组和 siRNA-PLC β 4(+)组。(-)组给予 1H 处理、(+)组给予 IH+orexin-A干预处理后继续培养48h,提取各组海马神经元总蛋白,采用Western blot法检测p-ERK1/2的表达。6.将体外培养4d的大鼠海马神经元随机分为control siRNA(-)组、control siRNA(+)组、siRNA-PLCβ1(-)组、siRNA-PLCβ1()组、siRNA-PLCβ 4(-)组和 siRNA-PLC β 4(+)组。(-)组给予 IH 处理、(+)组给予 IH+orexin-A干预处理继续培养48h,收集各组细胞Annexin V-PE/7AAD双染后入流式细胞仪进行细胞凋亡率检测。结果1.细胞形态学特征:刚种植时所有细胞呈圆形,胞体小而透亮,大小均匀,悬浮分布于种植液中。种植24h后可见细胞贴壁良好,胞体增大,折光性好,呈梭形或不规则形,绝大部分细胞伸出短小突起。种植40h后神经元胞体进一步增大,突起明显伸长,可见清晰树突和轴突,相邻细胞间形成联系,突起进一步延伸,相互交织成网状。第7-10天胞体饱满透亮,突起连接更为紧密,细胞呈现集中分布趋势。2.神经元纯度检测:将培养8d的海马神经元爬片采用免疫细胞化学技术,神经元的胞浆和突起被染成绿色,镜下计数后神经元纯度可达90.5%。3.海马神经元凋亡率检测:①海马神经元经间歇性缺氧处理后,分别于6h、24h、48h进行神经细胞凋亡率检测,结果显示,海马神经元的凋亡率逐渐从6.73±1.22%上升至 10.80±0.92%、15.5±1.51%和 25.8±2.01%。②海马神经元给予间歇性缺氧再经过orexin-A干预处理,48小时后进行细胞凋亡率检测。与单纯给予间歇性缺氧的海马神经元凋亡率(26.8±1.87%)相比,orexin-A处理后海马神经元凋亡率增加,分别是28.5±2.11%(orexin-A 1Nm/L)、31.8±1.98%(orexin-A3Nm/L)、36.2±2.27%(orexin-A 10Nm/L)和 35.5±2.46%(orexin-A 100Nm/L)并随orexin-A终浓度的升高而进一步增加。当orexin-A 终浓度≥10Nm/L时,海马神经元凋亡率有显著性增高(P<0.05)。4.慢病毒转染效率测定三组腺病毒(control siRNA、siRNA-PLCβ1 和 siRNA-PLCβ4)转染效率均>90%。5.Orexin-A加重缺氧海马神经元损伤的作用通过ERK1/2磷酸化产生①大鼠海马神经元给予间歇性缺氧处理后,与对照组相比p-ERK1/2表达量增加(P<0.05);再加入orexin-A作用后,p-ERK1/2表达量进一步升高,显著高于IH组(P<0.05);给予U0126预处理后,海马神经元p-ERK1/2表达量低于IH+orexin-A 组(P<0.05)。②IH组大鼠海马神经元与对照组相比凋亡率增加(P<0.05);加入orexin-A作用后,细胞凋亡率较IH组又明显升高(P<0.05);给予U0126预处理的IH+orexin-A组海马神经元凋亡率较IH+orexin-A组显著降低(P<0.05)。(见图3)6.Orexin-A通过PLCβ1引起ERK1/2磷酸化加重缺氧海马神经元损伤①大鼠海马神经元经过IH+orexin-A处理后,control siRNA(+)组和siRNA-PLCβ4(+)组p-ERK1/2表达量分别较各自对照组control siRNA(-)组和siRNA-PLCβ4(-)组显著升高(P<0.05);而 siRNA-PLCβ1(+)组经过 IH+orexin-A处理后,p-ERK1/2表达量较对照组siRNA-PLCβ1(-)组无明显变化。②沉默大鼠海马神经元PLCβ1基因后给予IH+orexin-A处理,细胞凋亡率较对照组siRNA-PLCβ1(-)组明显降低(P<0.05);而沉默大鼠海马神经元PL Cβ1基因组和空病毒组细胞凋亡率较各自对照组无明显变化。结论1.本课题所采用方法培养的大鼠海马神经元在数量、纯度及存活能力方面均较好。2.间歇性缺氧诱导的海马神经元凋亡是一个渐进性过程,呈时间依赖性。3.Orexin-A对缺氧海马神经元具有损伤性作用。同时这种损害性作用具有浓度依赖性,在orxin-A终浓度≥10Nm/L时出现,随着orexin-A终浓度的增加,细胞凋亡率增加。4.Orexin-A加重缺氧海马神经元损伤的作用通过ERK1/2磷酸化产生。U0126可抑制orexin-A诱导的ERK1/2磷酸化水平升高,减轻orexin-A对缺氧状态下海马神经元的损伤性作用,降低细胞凋亡率,发挥了细胞保护作用。5.Orexin-A通过PLC亚单位-PLCβ1引起ERK1/2磷酸化加重缺氧海马神经元损伤,而不是PLCβ4。