论文部分内容阅读
目的:肿瘤疫苗开发成本高昂且肿瘤细胞有免疫逃逸等特性,本研究在抗原-抗体结合和受配体结合理论的基础上,引入新的免疫原(DOX-BSA)刺激机体产生抗DOX抗体,并在小分子(FA-DOX)桥联作用下靶向肿瘤细胞,以期得到一种可增强肿瘤细胞免疫原性的廉价复合物大分子达到清除肿瘤细胞并长期检测的目的。免疫疗法毒副作用小且效果持久温和,但免疫治疗周期较长,为防止肿瘤过度发展,因此在免疫治疗前期介入Fu泡囊给药系统抑制肿瘤的发展进程,提高治疗效果。方法:1)通过缩醛法合成制备泡囊所需高分子材料F127-Chol并对其进行纯化和鉴别。2)溶剂注入法制备Fu泡囊,分别采用超滤离心法和透析法测定包封率,以粒径和包封率为评价指标,采用单因素考察法对泡囊的处方及其制备工艺进行优化,对制备的泡囊的粒径、电位、包封率进行测定,通过透射电镜观察制备的泡囊的形态,对泡囊在模拟正常体液和模拟癌细胞环境的释放规律进行考察。3)为考察泡囊在体外的抗肿瘤活性,以鼠源性乳腺肿瘤细胞4T1为肿瘤模型细胞,通过细胞毒性试验(MTT法)考察泡囊杀死肿瘤细胞的能力,并进一步通过流式细胞仪检测与药物共包载于泡囊内的荧光物质罗丹明G6的摄取量,考察泡囊进入肿瘤细胞的能力。4)以4T1细胞、5-6周龄的雌性balb/c小鼠建立动物模型,以瘤体积增长倍数和抑瘤率为指标,考察泡囊实际的抗肿瘤效果。5)为获得所需免疫原,以戊二醛交联法合成外源性半抗原DOX-BSA,以透析法纯化后,通过紫外-可见分光光度法和傅里叶转换红外分光光度法对其进行鉴别。6)为评估所得免疫原的免疫原性,以5-6周龄的雌性balb/c小鼠为模型动物,制备多克隆抗体,并通过ELISA以游离DOX竞争抑制后测定,绘制相应抑制标准曲线。7)合成分子桥FA-DOX,以不良溶剂沉淀纯化后,通过液-质联用和核磁共振法对其进行鉴定。8)为证实免疫复合物大分子的存在及分子桥在免疫复合物形成过程中的作用,以4T1细胞为模型细胞,含抗阿霉素抗体的小鼠抗血清为抗体,二抗-HRP为检测信号标志物,测定其细胞酶联免疫吸附分析法的吸光度值,考察肿瘤细胞FR~FA-DOX~抗血清~二抗-HRP免疫复合物的形成;为考察FA-DOX分子桥的主动靶向功能及化疗效果,分别进行了流式细胞摄取试验、荧光显微镜和细胞毒性试验。9)为考察免疫治疗联合化疗的抗肿瘤效果,以4T1细胞、5-6周龄的雌性balb/c小鼠建立动物模型,以瘤体积增长倍数和抑瘤率为指标,考察该复合疗法实际的抗肿瘤效果;以组织切片图谱为基础,考察不同给药组别对肿瘤细胞的杀伤情况以及其对其他器官的毒性。结果:1)制备的材料纯化后,经傅里叶转换红外分光光度法和核磁共振氢谱结果均证明成功合成了高分子材料F127-Chol。2)制得的泡囊为较规整球形,平均粒径(240.4?10.07)nm,Zeta电位-68.37 m V,FALT为1.83 nm;包封率32.76%;体外释放符合Weibull模型,在模拟正常体液的环境中释放药物明显减缓(t1/2为游离Fu的3.47倍)。3)细胞毒性试验(MTT法)结果显示,泡囊对4T1的细胞毒性呈现时间及浓度依赖性,24 h时各组IC50(μg.ml-1)值分别为:泡囊38.02±1.93;以市售材料制备的对照泡囊71.78±2.17;空白泡囊+游离药物193.57±2.29;游离药物207.068±3.58;空白泡囊927.14±5.93。流式细胞摄取术结果显示,细胞摄取:泡囊>空白泡囊+药≈游离药物。4)荷瘤鼠在给药第23天时,泡囊组、对照泡囊组、Fu组和生理盐水组的肿瘤体积增长倍数分别为64.44、81.16、105.87、150.28,算得各组抑瘤率依次为52.49%、33.90%和20.85%,泡囊组均明显高于对照泡囊组及Fu组(p<0.05)。5)制备的免疫原DOX-BSA纯化后,经紫外-可见风光光度法和傅里叶转换红外分光光度法分析,均表明DOX-BSA合成成功。6)ELISA法证实,获得的多克隆抗体能明显被DOX竞争性抑制,且其IC50值为75.77±2.81 ng.ml-1,完全达到本研究所需灵敏度。7)液相-质谱联用检测和核磁共振氢谱均证明分子桥FA-DOX合成成功。8)细胞ELISA试验中,FA-DOX+抗血清组>>FA-DOX+阴性血清组>FA+DOX+抗血清组>PBS组>FA-DOX+PBS组,分别为FA-DOX+阴性血清组的1.76、FA+DOX+抗血清组的2.13、PBS组的2.45和FA-DOX+PBS组的2.87倍;除FA-DOX+抗血清组外其余各组与PBS组比较均无显著性差异(P均>0.05),证明了目标大分子免疫复合物的存在,且抗体和FA-DOX在该复合物中缺一不可。流式细胞摄取术结果显示,给药2 h时各组细胞摄取阿霉素含量的规律为:FA-DOX组>FA+FA-DOX组>DOX,且FA-DOX组为DOX组的1.45倍,为FA+FA-DOX的1.05倍,说明分子桥FA-DOX有明显的靶向功能,且游离叶酸的加入可限制分子桥的摄入。荧光显微镜检测结果表明:各组细胞内荧光强度均随时间延长而增强,表明随着时间进展药物的摄取量增加,其中,2 h时,各组摄取均较少,因此,组间差异并未明显体现出来,与流式细胞摄取术结果吻合。4 h时,FA-DOX组的摄取量分别为DOX组的2.09倍和FA+FA-DOX组的1.71倍,显著高于DOX组和FA+FA-DOX组;另外,FA+FA-DOX组仅为DOX组的1.22倍,说明FA-DOX进入细胞通过FA介导的FA-FR途径,且受游离FA的竞争性抑制。6 h的结果与4 h类似,其中,FA-DOX组的摄取量分别为DOX组的2.06倍和FA+FA-DOX组的1.76倍;FA+FA-DOX组为DOX组的1.19倍。在MTT试验中FA-DOX各时间点的细胞IC50(μg.ml-1)分别为:24h:0.99±0.02;48h:0.28±0.07;72h:0.26±0.04。各组对4T1的细胞生长抑制率依次为:FA-DOX>>FA+FA-DOX>DOX。9)在荷瘤鼠体内抑瘤试验中,当给药第27天时,各组的肿瘤体积增长倍数分别为:生理盐水为36.16、免疫+FA-DOX+泡囊为8.99、免疫+FA-DOX+对照泡囊为12.75、免疫+FA-DOX+Fu为15.08、免疫+FA-DOX+生理盐水为18.98、免疫+FA+DOX+泡囊为17.68、免疫+FA+DOX+对照泡囊为22.40和FA-DOX+泡囊为13.04;以生理盐水组为基准,算得以上其余各组的抑瘤率依次分别为75.15%、64.73%、58.29%、47.48%、48.89%、38.06%和63.93%。H&E染色结果表明:与生理盐水组对比,各给药组肿瘤组织出现不同程度的细胞损伤及出血,其中损伤程度依次为免疫+FA-DOX+泡囊组>免疫+FA-DOX+Fu组>免疫+FA-DOX+生理盐水组≈FA-DOX+泡囊组>免疫+FA+DOX+泡囊组>生理盐水组。结论:制得的泡囊理化性能较好,有利于将药物传输至癌组织释放并发挥作用,细胞试验、动物试验均表明疗效显著。合成的免疫原产生了较好的免疫效果,与相应分子桥联合使用时可生成免疫复合物大分子,有助于提升机体对肿瘤细胞的识别能力,联合使用化疗和免疫治疗可改善两种疗法固有的缺陷,获得了良好的抗肿瘤能力。