论文部分内容阅读
研究背景和目的结肠癌是常见的消化系统恶性肿瘤,近年来在世界范围内结肠癌的发病率逐年上升。研究表明,环境化学因素是其发病率上升的主要原因之一。其中肉类经高温烹制所产生的杂环胺类化合物是结肠癌的主要致癌物之一。这类致癌物经代谢激活后,作用于结肠粘膜上皮细胞的DNA形成DNA加成物,从而引起正常的结肠组织癌变。因此寻找安全有效的途径增强致癌物的代谢解毒,减少致癌物的激活,对降低结肠癌的发病率具有重要的公共卫生学意义。莱菔硫烷(sulforaphane, SFN)是一种富含于十字花科植物的化学保护剂。流行病学及药理学研究表明,SFN对肺、肝、胃、前列腺、乳腺、结肠等器官的恶性肿瘤具有化学预防作用。在肿瘤的始发突变阶段,SFN主要通过以下两种机制预防肿瘤的发生：一方而,通过激活Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Kelch-like ECH-associated proteinl, Keap1)-核因子E2P45相关因子2(NF-E2-related factor2, Nrf2)-抗氧化反应元件(antioxidant response element, ARE)通路,诱导包括尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UDP-glucuronosyltransferase, UGT)和内的Ⅱ相代谢酶的表达,降低致癌物的毒性并增加致癌物的排出。另一方面,通过抑制以细胞色素P450(cytochrome P450, CYP)为代表的Ⅰ相代谢酶,如CYP1A1、 CYP2B1/2、CYP3A4(?),抑制致癌物的激活。细胞自噬是近年来的研究热点,它在肿瘤等疾病的发生发展中具有重要作用。而最近研究表明,低浓度的植物化学保护剂SFN可诱导前列腺癌、结肠癌、乳腺癌等肿瘤细胞系产生细胞自噬效应,且证实了联合自噬抑制剂如3-甲基腺嘌吟(3-methyladenine,3-MA)或巴伐洛霉素A1(bafilomycin A1)可以提高SFN对肿瘤细胞的毒性,增强SFN阻滞细胞周期及诱导细胞凋亡的效应,使SFN对肿瘤的化学预防作用增强。雷帕霉素(rapamcin, Rapa)是一种常用的细胞自噬诱导剂,它通过抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)上调细胞自噬水平。Rapa也可抑制多种肿瘤细胞的生长,与其他抗肿瘤药物联用具有协同抗肿瘤的作用.上述抗肿瘤研究主要着眼于肿瘤的进展阶段,通过SFN与白噬抑制剂联合作用以增强SFN抑制肿瘤细胞生长,促进肿瘤细胞死亡。然而SFN通过调节Ⅰ、Ⅱ相代谢酶、减少致癌物的攻击从而遏制肿瘤始发的抗肿瘤机制具有更重要的肿瘤预防意义。Caco-2人结肠癌细胞具有正常肠道上皮细胞的相关特性,是研究UGT及CYP3A4的成熟模型。本研究以此为模型,以CYP3A4及UGT1A1、 UGT1A8、UGT1A10为Ⅰ、Ⅱ相代谢酶的代表,探讨自噬调节剂3-MA及Rapa对SFN诱导细胞自噬效应的影响以及对SFN诱导Ⅰ、Ⅱ相代谢酶的调控,并进一步研究其内在机制,为结肠癌的化学预防提供新思路。方法1.实验分为对照组(不加药处理)、单药处理组(分别为SFN、3-MA及Rapa组)、联合处理组(SFN+3-MA及SFN+Rapa组)。2.倒置相差显微镜观察各组Caco-2细胞的生长状态及形态变化；cellcounting kit-8(CCK8)法检测各组细胞的生长抑制率。根据各组细胞生长状态及生长抑制率,选取细胞毒性较小的药物作用条件进行以下实验。3. western blot法测定各组细胞微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein1light chain3, LC3)蛋白的表达；免疫荧光法观察各组细胞LC3的胞内分布；透射电镜观察各组Caco-2细胞的超微结构。4.实时荧光定量PCR法测定各组细胞UGT1A1、UGT1A8、UGT1A10、hPXR及CYP3A4mRNA的表达。western blot法测定各组细胞UGT1A1蛋白的表达；免疫荧光法观察各组细胞Nrf2的核内转位。结果1.通过倒置显微镜观察及CCK8实验检测,选取25μM SFN、2.5mM3-MA、10nM Rapa单独或联合作用于细胞。2.SFN对LC3-Ⅱ蛋白的诱导呈浓度和时间依赖性增加,3-MA及Rapa可分别减弱或增强LC3-Ⅱ蛋白的表达；透射电镜观察发现Rapa、SFN及SFN+Rapa等处理组的细胞内有自噬囊泡结构的形成。3.与对照组相比,SFN组可诱导UGT1A1、UGT1A8、UGT1A10mRNA的表达增强(P值均小于0.05),SFN+Rapa组可进一步诱导UGT1A1、UGT1A8、 UGT1A10mRNA的表达增强(P值均小于0.05)；SFN+3-MA组的UGT1A同工酶mRNA与对照组相比差异无统计学意义(P值均大于0.05)。与对照组相比,SFN及SFN+3-MA、SFN+Rapa等处理组可诱导Nrf2核内转位增强,且SFN+Rapa组更为明显。与对照组相比,Rapa组及SFN+Rapa组的hPXR mRNA表达增强,差异有统计学意义(P值均小于0.05)。4.与对照组相比,Rapa、SFN及SFN+Rapa等处理组的CYP3A4mRNA的表达降低,且SFN+Rapa组与SFN组相比,差异无统计学意义。而SFN+3-MA组的表达较SFN组升高,差异有统计学意义(P值均小于0.05)。结论1. Rapa可增强SFN诱导Caco-2细胞的自噬效应,增强SFN对UGT1A1、 UGT1A8及UGT1A10的诱导,且不影响SFN对CYP3A4的抑制作用。其增强UGT1A司工酶的机制可能是Rapa同时促进了SFN对Nrf2和hPXR信号通路的诱导激活。提示通过对Ⅱ相代谢酶的诱导,自噬诱导剂可进一步增强SFN对结肠癌的化学预防作用。2.3-MA可抑制SFN诱导Caco-2细胞的自噬效应,降低SFN对UGT1A1UGT1A8及UGT1A10的诱导,并且3-MA干扰了SFN对CYP3A4的抑制作用。提示自噬抑制剂可干扰SFN对Ⅱ相代谢酶的诱导和对Ⅰ相代谢酶的抑制,从而不利于SFN在肿瘤始发突变阶段对结肠癌的化学预防效应。