线粒体是大多数真核细胞内的一种双膜细胞器,可通过氧化磷酸化作用产生三磷酸腺苷(Adenosine Triphosphate,ATP)为细胞提供能量。线粒体参与了细胞内的氧化还原平衡、内部信号调节、增殖与凋亡等重要生理过程。其功能的紊乱会影响人体健康,并与一系列相关疾病的发生发展相关,如代谢综合症、肥胖、心血管疾病、神经退行性疾病、肿瘤等。大量研究表明,食品中的营养功能因子可促进人体健康,而在食品加工过程中产生的危害物会损害健康,但在分子层面上,食品危害物和功能因子在体内作用的具体分子机制尚不十分明确,而线粒体可能是其在细胞内发挥作用的重要靶点。丙烯酰胺(Acrylamide,ACR)是高淀粉食品在高温加热加工过程中经由美拉德反应产生的食品危害物,具有一定的神经毒性和生殖毒性,长期暴露会危害机体健康;芝麻酚(Sesamol)是芝麻油中的一种脂溶性木脂素类化合物,是芝麻油香气成分的重要组成物质,具有抑菌、抗氧化、抗癌等多种生理活性。目前丙烯酰胺和芝麻酚对细胞内线粒体功能的调控机制尚未有明确报道。因此,本研究以食品危害物丙烯酰胺和食品功能因子芝麻酚为研究对象,研究其对细胞内线粒体相关的能量代谢、信号调节等生理过程的调控机制,为丙烯酰胺的神经毒性防控和芝麻酚的功能活性提供理论依据。本文的研究内容和结果如下:1.丙烯酰胺诱导神经小胶质细胞毒性与线粒体调控机制(1)研究了丙烯酰胺诱导BV2神经小胶质细胞的炎症反应与线粒体依赖性的细胞凋亡。丙烯酰胺可以抑制BV2细胞活力并诱导其凋亡,且具有浓度依赖性;丙烯酰胺能够降低线粒体膜电势和Bcl-2/Bax比值,增加细胞色素c的释放,激活caspase通路,进而引起细胞凋亡;丙烯酰胺能够抑制细胞存活信号蛋白Akt的磷酸化,激活细胞死亡和炎症信号蛋白JNK和p38;同时,炎症转录调控因子NF B及其下游诱导型一氧化氮合酶(i NOS)的表达量及细胞NO的产量增加,提示丙烯酰胺具有促进炎症反应的作用。此外,丙烯酰胺处理能够上调转录调控因子Nrf2的表达,但并未促进其向核内转移。(2)研究了丙烯酰胺对BV2细胞线粒体能量代谢和细胞内氧化还原平衡状态的影响。丙烯酰胺通过抑制电子传递链复合物I、II、IV亚基的表达,降低线粒体基础代谢率、氧化磷酸化水平、以及最大呼吸能力,降低了线粒体的能量代谢能力;丙烯酰胺和GSH的亲电子反应使细胞内GSH/GSSG下降,并使得细胞内过氧化氢产量增多,导致氧化还原状态失衡;GSH的前体物N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)可以有效降低丙烯酰胺引起的线粒体功能紊乱及复合物表达异常,并且通过增加细胞内GSH水平,维持细胞内氧化还原平衡。此外,NAC还可降低丙烯酰胺诱导的BV2细胞凋亡和炎症反应。以上结果表明丙烯酰胺诱导的线粒体功能紊乱和氧化还原状态失衡是引起神经小胶质细胞发生线粒体途径凋亡和炎症反应的主要机制。2.芝麻酚诱导肝癌细胞凋亡及调控线粒体功能的分子机制(1)研究了芝麻酚对Hep G2人肝癌细胞的促凋亡作用机制。Hep G2细胞经芝麻酚处理后,细胞活力下降并发生凋亡,并呈现浓度依赖性和时间依赖性;进一步试验表明,芝麻酚能够诱导线粒体膜电势下降使其功能失活,激活线粒体依赖的凋亡通路;同时,芝麻酚可以抑制存活信号蛋白Akt的活化,促进死亡信号蛋白JNK和p38的激活。(2)研究了芝麻酚对Hep G2细胞自噬、线粒体自噬的影响以及与凋亡之间的关系。研究发现芝麻酚可以显著地抑制Hep G2细胞自噬相关信号通路PI3K Class III/Beclin 1,以及自噬特征性蛋白LC3的表达,表明芝麻酚可以抑制Hep G2细胞自噬。通过共聚焦成像结果可知芝麻酚抑制了Hep G2细胞的线粒体自噬。自噬促进剂雷帕霉素可以有效抑制芝麻酚诱导的细胞凋亡,提示芝麻酚可能是通过抑制细胞自噬促进了细胞凋亡。能量代谢流分析表明,芝麻酚诱导肝癌细胞Hep G2线粒体能量代谢下降、糖酵解水平上升。(3)通过紫外光谱(UV/Vis)、荧光光谱、圆二色谱(CD)、红外色谱(FT-IR)等多种光谱手段以及分子模拟等方法研究了芝麻酚与DNA的相互作用机制。荧光光谱分析结果表明ct DNA对芝麻酚的荧光产生了静态淬灭,并且氢键作用力和疏水作用力是两者间的主要作用力。圆二色谱结果表明芝麻酚与ct DNA之间形成了复合物,并影响ct DNA的二级构象。红外光谱结果表明ct DNA上的磷酸基团和碱基均与芝麻酚发生了相互作用。以上光谱学分析结果均表明两者之间是以小沟结合方式相互作用的而非嵌插作用。进一步的分子模拟结果同样表明,芝麻酚与DNA的结合方式为小沟沟渠结合。以上结果表明,芝麻酚可能是通过抑制Hep G2细胞线粒体活力和线粒体自噬,使损伤的线粒体积累并影响细胞能量代谢状态,促进了线粒体依赖性细胞凋亡,并且阐明了芝麻酚与DNA的结合方式和作用力。