论文部分内容阅读
前言癌症对人类健康和生命的威胁很大。手术、化疗、放疗是治疗恶性肿瘤的三大传统疗法，有着各自的缺点。过继免疫治疗法是将有免疫活性的自体的或同种异体的免疫细胞及或其产物输给患者，为患者提供现成的免疫力，以达到治疗目的。这种方法与其它抗肿瘤药物相比，可以在没有损伤机体的免疫系统结构和功能的前提下，直接杀伤肿瘤细胞，并且调节和增强机体的免疫功能。用于过继免疫治疗的活性细胞必须具有较强的细胞活性和增殖力，CIK细胞被认为是新一代抗肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案。本实验室对CIK细胞的研究有着丰富的经验，到目前为止已成功地用CIK细胞治疗了400多例的肿瘤患者，并有深入研究。本实验观察了不同年龄的正常人与肿瘤患者PBMC在体外经多种因子诱导后，其扩增能力和对肿瘤细胞株的杀伤力的差别，为临床上应用CIK细胞治疗肿瘤提供实验依据。材料与方法1、实验材料（1）临床资料正常人外周血样本10例，采自本单位男性健康志愿者，25～30岁：5例，50～60岁：5例；患者外周血样本33例，采自中国医科大学附属第一医院肺鳞癌男性患者（全部病理经2名病理医师确诊），年龄41～75岁。（2）肿瘤细胞株人乳腺癌细胞株（MDA-MB-231）、肺癌细胞株（BE-1）、前列腺癌细胞株（PC-3）。（3）试剂胎牛血清、胰蛋白酶、RPMI-1640培养基、MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒、人淋巴细胞分离液（Ficoll-Paque Plus）、抗CD3单克隆抗体（anti-CD3 monoclonal antibody,MabCD3）、基因重组人白介素2（interleukin-2,IL-2）、基因重组人白介素1α（interleukin-1α，IL-1α）、基因重组人干扰素γ（interferon-γ，IFN-γ）。（4）实验设备倒置荧光显微镜、离心机、二氧化碳培养箱、超净台、电脑压力蒸汽灭菌器2、实验方法（1）CIK细胞的制作用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞（PBMC），加入IFN-γ、IL-2、IL-1、CD3McAb诱导CIK细胞的生成。（2）CIK细胞增殖的测定细胞记数板法计数细胞。（3）肿瘤细胞的培养含10％小牛血清的RPMI-1640培养液培养。（4）MTT法测CIK细胞杀瘤活性培养14天的CIK细胞作为效应细胞，三种肿瘤细胞株作为靶细胞，以20：1效靶比分别把效应细胞和靶细胞加入96孔板，另设靶细胞和单独效应细胞组，每组设三个复孔，培养48小时后用MTT法测定杀伤活性，公式如下：杀伤活性（％）=[1-（实验组OD值-单独效应细胞OD值）／单独靶细胞OD值]*100％（5）统计学处理结果1、CIK细胞的增殖与正常人CIK细胞相比，肿瘤患者CIK细胞的增殖速度较慢，其最大增殖倍数也略低，同时发现CIK细胞的增殖速度与年龄有关，即年龄越小CIK细胞的扩增能力越强。2、MTT法测定CIK细胞的杀伤活性（1）正常人、肿瘤患者CIK细胞对3种肿瘤细胞株的抑瘤比较将培养14 d的CIK细胞以20：1效靶比杀伤3种肿瘤细胞株（MDA-MB-231,BE-1,PC-3），正常人的CIK对三种肿瘤细胞株（MDA-MB-231,BE-1,PC-3）的杀伤率分别为75.80±10.1，74.2±8.5，81.3±9.6，明显高于肿瘤患者（P＜0.01）。（2）不同年龄段肿瘤患者CIK细胞对3种肿瘤细胞株的抑瘤比较将肿瘤患者按年龄段分组，50-60岁、60-70岁、＞70岁组对三种肿瘤细胞株的杀伤率明显低于＜50岁组（P＜0.05）；50-60岁、60-70岁两组之间杀伤率没有显著差别（P＞0.05），但均明显高于＞70岁组（P＜0.05），可以认为CIK细胞对肿瘤的杀伤力与年龄有关，即年龄段越高，杀伤力越弱。讨论本研究将正常人和肿瘤患者的PBMC在同等条件下用相同的细胞因子诱导CIK细胞。研究发现，不同来源的个体中获得的CIK细胞，其增殖率及杀伤力各不相同，即正常人较肿瘤患者CIK细胞增殖能力和杀伤力强，低年龄组CIK细胞增殖能力和杀伤力较高年龄组强。与杜清友等曾经观察过正常人CIK细胞及肝癌患者的CIK细胞的体外增殖情况一致，即与正常人的CIK细胞相比，肝癌患者CIK细胞的增殖速度较慢且其最大增殖倍数也略低。其原因很可能是患者本身的PBMC细胞的性质所造成的。肿瘤免疫学研究表明，机体的免疫功能状态随着肿瘤的不断生长而进行性下降，特别是晚期带瘤机体的各种特异性和非特异性的细胞与体液免疫功能均受到显著的抑制。国内外很多研究结果指出，多数肿瘤患者有T细胞亚群状态异常和比例失调，其CD4／CD8比值的降低与病变程度相关。而且随着肿瘤的生长，进入血液中的肿瘤抗原可与特异性抗体结合形成复合物，后者可以抑制T细胞对瘤细胞的识别与攻击，使T淋巴细胞的杀伤力减弱。另外，在肿瘤抗原的作用下，机体还会出现抑制性细胞，他们对诱导杀伤性T细胞的产生和抗体生成都起抑制性作用。这些因素都可能抑制CIK细胞的杀伤力。本研究还发现，年龄越小CIK增殖力和杀伤力就越强，可能与CIK细胞培养上清中细胞因子的浓度不同、不同年龄来源的细胞增殖率有一定差异等有关，也可能与内分泌系统分泌的激素调节有关，其作用机理还有待于进一步探讨。总之，CIK是新一代肿瘤过继免疫治疗的主力军，有着广泛的治疗前景。结论CIK细胞的体外增殖力及对肿瘤细胞的杀伤活性与机体的年龄及状态有关，即低年龄组强于高年龄组，正常人CIK细胞的体外增殖力及对肿瘤细胞的杀伤活性强于肿瘤患者的CIK细胞。