论文部分内容阅读
心肌梗死(Myocardial infarction,MI)是缺血性心脏病中最为严重的疾病之一。C反应蛋白(C reactive protein,CRP)是一类急性反应蛋白,是心血管疾病中重要的炎症标记物,但其在心血管疾病进程中的作用尚属未知。本研究拟通过在H9c2心肌细胞和大鼠心肌缺血模型中沉默CRP基因,通过体外和体内实验探索CRP基因是否调控心肌缺血过程中的重要因子miR-21及其靶基因PDCD4、PTEN和Spry1,了解缺血过程中心肌损伤的全新的分子机理。体外实验:设计并构建三组特异性沉默CRP基因的慢病毒载体和一组无敲减作用的对照组慢病毒载体,筛选出沉默CRP基因效率最佳的慢病毒载体。通过MTT实验分析CRP沉默组和对照组中H9c2心肌细胞的活性,并以实时定量PCR检测CRP基因沉默后H9c2心肌细胞中miR-21及其靶基因PDCD4、PTEN和Spry1 mRNA表达情况。体内实验:随机选取野生型与CRP敲除型雄性SD大鼠各8只,分别设为假手术组和手术组(每组4只)。通过结扎左前降支冠状动脉建立心肌缺血模型,缺血50 h后收集心脏组织并制作冰冻切片,根据病理染色后心肌细胞形态的完整性区分并捕获假手组、手术组正常区和缺血区的心肌细胞,采用实时定量PCR检测大鼠不同组别中各区域的miR-21及其靶基因PDCD4、PTEN和Spry1 mRNA表达情况。MTT实验结果表明CRP沉默后H9c2心肌细胞活性(0.78±0.030)显著高于对照组(0.66±0.010,P<0.05)。同时,CRP沉默后miR-21的水平显著上调并高于对照组(P<0.01),相应的靶基因PDCD4、PTEN和Spry1的表达水平相应下调并显著低于对照组(P值均小于0.001)。在动物实验中,CRP敲除后假手术组大鼠的正常心肌细胞中miR-21水平显著高于野生型假手术组(P<0.05),其所抑制的靶基因PDCD4、PTEN和Spry1表达水平相应地低于野生型假手术组,与体外实验结果一致。在心肌缺血模型中,与相应的假手术组相比,野生型和CRP敲除型手术组缺血区的miR-21表达水平均上调,但CRP敲除后手术组缺血区miR-21水平由于基线较高,上调的幅度低于野生型大鼠。相应地,CRP敲除可以增加miR-21下游基因PDCD4和PTEN在假手术组和手术组缺血心肌中的表达差异。本研究通过体外和体内实验一致证明了CRP可以调控心血管疾病进程中的重要因子miR-21及其下游靶基因的表达。在大鼠心肌缺血模型中研究CRP敲除对miR-21及其靶基因的调控方式,推测CRP敲除对缺血心肌具有与缺血预适应相似的保护作用,提示CRP可能是开发新型药物治疗缺血性心血管病的潜在作用靶点。