论文部分内容阅读
目的：构建重组人CYP3A5基因多态性酿酒酵母表达体系；评价CYP3A5基因多态性对氨氯地平等药物代谢的差异及效应的影响；初步探索microRNA对CYP3A5基因表达的调控。方法：1. CYP3A5基因多态性体外表达载体的构建及真核表达：通过PCR扩增得到CYP3A5各基因多态性cDNA全片段,PCR产物经双酶切后,将目的基因片段插入到经相同内切酶双酶切过的质粒pYES2/CT上,转化大肠杆菌JM109,用含氨苄青霉素的培养基培养,筛选阳性克隆,提取CYP3A5基因多态性重组表达质粒。将构建成功的重组表达载体CYP3A5-pYES2/CT转化酿酒酵母INVScl,用SG培养基诱导其蛋白表达,并提取酵母蛋白微粒体,即为CYP3A5药物代谢酶。2.研究CYP3A5基因多态性对相关药物代谢的影响：(1)体外代谢：将CYP3A5基因多态性酶代谢氨氯地平、地尔硫卓,非洛地平和中药三七总皂苷等药物,采用LC-MS和HPLC仪测定其代谢反应量,以曲线拟合方法优化分析,并计算Km、Vmax和Vmax/Km值,绘制米氏动力学曲线。(2)体内代谢：筛选湘雅三医院健康管理中心的服用氨氯地平原发性高血压患者57例和肾移植科服用地尔硫卓移植后高血压患者32例；分别治疗4周后抽取外周血,离心后提取血浆,一方面,模拟体内环境对血浆中药物进行CYP3A5酶处理,LC-MS和HPLC分别测定各处理组代谢前后的血药浓度,计算CYP3A5各基因型酶对氨氯地平和地尔硫卓的代谢速率；另一方面,对患者进行CYP3A5基因分型,LC-MS和HPLC测定各基因型患者氨氯地平和地尔硫卓血药浓度,分别计算其体内代谢速率。3.研究CYP3A5基因多态性对氨氯地平降压效应的影响：筛选湘雅三医院健康管理中心的服用氨氯地平原发性高血压患者57例,提取患者DNA,对患者进行CYP3A5的基因型检测,分为CYP3A5*1/*1,CYP3A5*1/*3,CYP3A5*4和CYP3A5*6四个不同的基因型组,在氨氯地平治疗前后分别测量各基因型组患者血压,记录治疗前后患者血压的变化情况,分析CYP3A5基因多态性对氨氯地平降压效应的影响。4.miRNA对CYP3A5基因表达的调控研究：使用targetscan、miRanda和Pictar等软件预测可能作用CYP3A5基因的miRNA,并进行统计和筛选,发现miR-410在很大程度与CYP3A5mRNA的3’-UTR结合；为了验证该结果,选用HepG2细胞进行转染实验,实验共分5组,分别为空白对照组,miR-410mimic(类似物)组,miR-410mimic阴性对照物组,miR-410inhibitor(抑制剂)组,miR-410inhibitor阴性对照物组；空白对照组加入等量的细胞培养液,转染48小时后,采用real-time和western-blot鉴定CYP3A5mRNA和蛋白质的表达。结果：1.CYP3A5基因多态性表达载体构建及表达：首次体外构建了人重组细胞色素CYP3A5酿酒酵母表达体系,包括CYP3A5*1/*1、CYP3A5*1/*3、CYP3A5*4和CYP3A5*6等4个单核苷酸突变株酿酒酵母表达载体,并成功在酿酒酵母细胞中进行真核表达。2.CYP3A5基因多态性对相关药物代谢的影响及差异：CYP3A5基因多态性对氨氯地平的代谢速率大小为：CYP3A5*1/*3>CYP3A5*6>CYP3A5wt>CYP3A5*4;对地尔硫卓的代谢速率大小为：CYP3A5wt>CYP3A5*6>CYP3A5*1/*3> CYP3A5*4;对非洛地平的代谢速率大小：CYP3A5wt>CYP3A5*4>CYP3A5*6>CYP3A5*3;对三七总皂苷的代谢速率大小：CYP3A5WT>CYP3A5*4>CYP3A5*6>CYP3A5*1/*3.体内和体外代谢速率大小一致。3.CYP3A5基因型测定及基因多态性对氨氯地平降压疗效的影响：(1)CYP3A5基因分型：对湘雅三医院健康管理中心的57名服用氨氯地平的高血压患者基因型的测定,结果发现服用氨氯地平的高血压患者中CYP3A5*1/*1共7名(12.3%),CYP3A5*1/*3共28名(49.1%),CYP3A5*4共2名(3.5%)和CYP3A5*6共2名(3.5%)；(2)CYP3A5基因多态性对氨氯地平降压效应的比较：与CYP3A5*1/*1基因型相比,CYP3A5*1/*3和CYP3A5*4基因型患者的氨氯地平降压疗效显著增强(P<0.05),CYP3A5*6基因型患者的降压疗效无明显差异；4.miR-410对CYP3A5基因表达的调控：与空白对照组相比,miR-410mimic转染组CYP3A5蛋白质表达水平明显升高(P<0.01),而miR-410inhibitor转染组结果正好相反(P<0.001),其他两个阴性对照组CYP3A5蛋白质的表达水平与空白对照组没有明显差异。各转染组的CYP3A5mRNA的表达水平无显著变化。结论：1.首次构建了重组人细胞色素CYP3A5基因多态性酿酒酵母表达体系。2.所构建的CYP3A5基因多态性酿酒酵母表达体系可以用于临床评价氨氯地平等药物的体内、外代谢和疗效的差异。3.miR-410参与CYP3A5蛋白表达的调控,是一种转录后调控机制。