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铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）在自然环境中广泛分布，是土壤中的常见病原菌之一，同时也是医院内三大易感染致病菌之一。铜绿假单胞菌可分泌多种次生代谢产物，被认为是重要的生物防治菌，其次生代谢产物不仅被发现具有广谱抗菌活性（如吩嗪类物质），还被认为有抑制炎症和细胞增殖的潜力（如环二肽）。而铜绿假单胞菌次生代谢产物的分泌与生物被膜（BF，bacterial biofilm）息息相关，同时也与群体感应系统（QSS，quorum sensing system）和六型分泌系统（T6SS，typeⅥsecretion system）有关，因此调控次生代谢产物合成与分泌的基因可能影响到生物被膜、群体感应系统和六型分泌系统相关基因的表达。
本实验通过建立脂多糖（LPS，lipopolysaccharide）诱导的RAW264.7小鼠巨噬细胞炎症模型，探究了铜绿假单胞菌分泌物CEPA（chloroform extract of Pseudomonas aeruginosa）和纯化产物1-羟基吩嗪（1-hydroxyphenazine）的体外抗炎活性及作用的分子机制；同时利用铜绿假单胞菌野生菌株2016NX1与构建的高产吩嗪菌株2019NES（可高表达phzR基因），探究了phzR基因对生物被膜、群体感应系统和六型分泌系统相关基因表达的影响。方法与结果如下：
1.采用MTT法检测细胞存活率，确定LPS、CEPA和1-羟基吩嗪对RAW264.7细胞存活率的安全浓度，以进行后续实验。结果显示，LPS在0~10μg/mL、CEPA在0~20μg/mL、1-羟基吩嗪在0~5μg/mL浓度范围内，对细胞活力无明显影响，为细胞安全浓度；
2.通过ELISA法测定了CEPA和1-羟基吩嗪对细胞分泌TNF-α水平的影响，结果表明二者均能抑制TNF-α的分泌，且呈浓度依赖性，药物浓度越高，抑制效果越明显；
3.形态学观察法确定CEPA和1-羟基吩嗪处理后细胞形态的变化，发现仅LPS刺激时，细胞体积增大、伸出伪足，同时加入CEPA或1-羟基吩嗪共同处理后，随药物浓度的增加，细胞体积减小，伪足变短，有恢复成正常细胞形态的趋势；
4.RT-qPCR法检测了炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA的表达水平变化，结果表明，CEPA和1-羟基吩嗪均能抑制TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA的相对表达，随着两种药物浓度的增加，TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA的表达水平逐渐下降，说明CEPA和1-羟基吩嗪对mRNA的表达有抑制作用；
5.RT-qPCR法比较了铜绿假单胞菌野生菌株2016NX1和工程菌株2019NES二者生物被膜（filC、pslA、pelA、pilA）、群体感应系统（lasR）和六型分泌系统（hcp1、hcp2、hcp3）基因的表达差异，结果表明，浮游状态下仅lasR和pilA有显著差异，2019NES的表达水平低于2016NX1，被膜状态下lasR、pslA和pelA有显著性差异，同样是2019NES的表达水平较低；
6.采用结晶紫染色法测定了2016NX1和2019NES在12h、1d、3d和6d时间段内生物被膜量的表达，结果显示，随着培养时间增加，两种菌株生物被膜的量均呈上升趋势，但2016NX1生物被膜的量持续高于2019NES；
7.利用平板分析法比较了2016NX1和2019NES蹭行运动（twitching）、泳动（swimming）和集群运动（swarmming）的能力，表明二者蹭行运动能力相同，泳动能力2019NES强于2016NX1，集群运动能力2016NX1强于2019NES。
综上，CEPA和1-羟基吩嗪能抑制炎性因子的分泌、降低炎症基因的表达、有助细胞恢复正常形态，有一定抗炎作用；同时，phzR基因可影响生物被膜、群体感应系统和六型分泌系统相关基因的表达，降低生物被膜量的形成，并对细菌运动性产生影响。
本实验通过建立脂多糖（LPS，lipopolysaccharide）诱导的RAW264.7小鼠巨噬细胞炎症模型，探究了铜绿假单胞菌分泌物CEPA（chloroform extract of Pseudomonas aeruginosa）和纯化产物1-羟基吩嗪（1-hydroxyphenazine）的体外抗炎活性及作用的分子机制；同时利用铜绿假单胞菌野生菌株2016NX1与构建的高产吩嗪菌株2019NES（可高表达phzR基因），探究了phzR基因对生物被膜、群体感应系统和六型分泌系统相关基因表达的影响。方法与结果如下：
1.采用MTT法检测细胞存活率，确定LPS、CEPA和1-羟基吩嗪对RAW264.7细胞存活率的安全浓度，以进行后续实验。结果显示，LPS在0~10μg/mL、CEPA在0~20μg/mL、1-羟基吩嗪在0~5μg/mL浓度范围内，对细胞活力无明显影响，为细胞安全浓度；
2.通过ELISA法测定了CEPA和1-羟基吩嗪对细胞分泌TNF-α水平的影响，结果表明二者均能抑制TNF-α的分泌，且呈浓度依赖性，药物浓度越高，抑制效果越明显；
3.形态学观察法确定CEPA和1-羟基吩嗪处理后细胞形态的变化，发现仅LPS刺激时，细胞体积增大、伸出伪足，同时加入CEPA或1-羟基吩嗪共同处理后，随药物浓度的增加，细胞体积减小，伪足变短，有恢复成正常细胞形态的趋势；
4.RT-qPCR法检测了炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA的表达水平变化，结果表明，CEPA和1-羟基吩嗪均能抑制TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA的相对表达，随着两种药物浓度的增加，TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA的表达水平逐渐下降，说明CEPA和1-羟基吩嗪对mRNA的表达有抑制作用；
5.RT-qPCR法比较了铜绿假单胞菌野生菌株2016NX1和工程菌株2019NES二者生物被膜（filC、pslA、pelA、pilA）、群体感应系统（lasR）和六型分泌系统（hcp1、hcp2、hcp3）基因的表达差异，结果表明，浮游状态下仅lasR和pilA有显著差异，2019NES的表达水平低于2016NX1，被膜状态下lasR、pslA和pelA有显著性差异，同样是2019NES的表达水平较低；
6.采用结晶紫染色法测定了2016NX1和2019NES在12h、1d、3d和6d时间段内生物被膜量的表达，结果显示，随着培养时间增加，两种菌株生物被膜的量均呈上升趋势，但2016NX1生物被膜的量持续高于2019NES；
7.利用平板分析法比较了2016NX1和2019NES蹭行运动（twitching）、泳动（swimming）和集群运动（swarmming）的能力，表明二者蹭行运动能力相同，泳动能力2019NES强于2016NX1，集群运动能力2016NX1强于2019NES。
综上，CEPA和1-羟基吩嗪能抑制炎性因子的分泌、降低炎症基因的表达、有助细胞恢复正常形态，有一定抗炎作用；同时，phzR基因可影响生物被膜、群体感应系统和六型分泌系统相关基因的表达，降低生物被膜量的形成，并对细菌运动性产生影响。