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肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-alpha,TNF-α）是一种强效的细胞因子,在参与免疫反应、炎症、损伤反应、控制细胞增殖、细胞分化以及细胞凋亡均能发挥作用。TNF-α及其抑制剂对于多种疾病的早期诊断、预后判断和治疗方面都有重要作用。猕猴川西亚种已用于多种人类重大疾病非人灵长类模型的构建,是研究TNF-α生物制剂对多种疾病影响的高价值实验动物。到目前为止,TNF-α在人和其他动物方面研究较多,但对猕猴TNF-α的研究较少,国内还未见猕猴川西亚种（Macaca mulatta lasiotis，Mm） TNF-α克隆表达的相关报道。本研究通过基因克隆技术获得MmTNF-α,并构建MmTNF-α基因的原核和真核表达菌株,并进行表达,为深入研究MmTNF-α蛋白活性功能、结构功能、制备单克隆抗体、开发检测试剂盒奠定物质基础,也为保护猕猴川西亚种提供资料。1、猕猴川西亚种TNF-α基因的克隆与原核表达参照NCBI/GenBank上登录的猕猴TNF-α mRNA序列设计一对引物,利用基因克隆技术获得MmTNF-α全长转录本为模板,PCR扩增目的基因,将其定向插入pMD-19T上,构建重组菌DH5a/pMD-19T-MmTNF-α,随机挑取阳性重组子进行PCR鉴定及序列测定分析。扩增获得的MmTNF-α基因为702bp,测序结果和GenBank上发布的猕猴TNF-α序列（NCBI Reference Sequence:NM001047149.1）比对,同源性为99%。根据测序成功的MmTNF-α基因序列设计合成一对表达引物,经亚克隆构建原核表达载体pGEX-4T-1-MmTNF-α,进行PCR、双酶切鉴定,并在E.coliBL21 （DE3）中进行表达。在37℃下,0.1mmol/L IPTG诱导表达原核表达菌株E.coli BL21（DE3）/pGEX-4T-1-MmTNF-α4 h,获得大小约为52 kDa且主要以包涵体形式存在的融合蛋白,与预期大小一致经过WB分析证实重组蛋白具有良好免疫反应性。2、猕猴川西亚种TNF-α真核表达载体的构建与表达将实验室克隆的MmTNF-α基因插入pPIC9K多克隆位点, Sal I线性化重组质粒pPIC9K-MmTNF-α,经电击转化GS115。PCR鉴定阳性克隆,用PCR、MM和MD平板进行转化子表型鉴定,G418梯度平板筛选高拷贝重组菌。重组菌pPIC9K-MmTNF-α/GS115利用甲醇诱导,SDS-PAGE和Western-blot分析表达结果。真核表达菌株GS115/pPIC9k-MmTNF-α表型鉴定为甲醇诱导缓慢型Muts,在30℃下,1%甲醇连续诱导72 h后在上清中检测到大小约为26 kDa的目的蛋白,WB分析表达产物具有免疫反应性。