人Dok5(dockingprotein5)全长cDNA由本室于1998年从人胎脑cDNA文库中分离克隆(提交Genebank，接收号为NM_018431)。本室前期对Dok5的表达谱分析表明：Dok5在神经系统、骨骼肌和心肌中高表达，提示其在神经系统和肌肉系统发挥相应的功能。 P19CL6细胞是小鼠胚胎性癌细胞P19衍生的细胞系，用含1％DMSO的培养基培养时，该细胞能高效的分化成搏动的心肌细胞：心肌特异性的转录因子如Nkx2-5、GATA-4和MEF2C表达上调，10天左右就可以观察到肌小节肌球蛋白重链的表达，P19CL6细胞是体外研究心肌细胞分化的良好模型。 为解决上述问题，我们首先将Dok5上游启动子区构建到荧光报告基因的质粒pGL3basic中，并构建了一系列5’端缺失体，结果发现包含Foxo3a结合元件(Forkheadbindingelement,FHBE)的-300至-240之间的序列明显的抑制报告基因的表达；对该区域的FHBE进行突变，这种抑制作用就明显减弱，提示FHBE很可能是存在于Dok5启动子区中的负调控元件；电泳迁移率变动分析法(EMSAElectrophoreticmobilityshiftassay)证实核中分布的Foxo3a可以结合于Dok5上游的FHBE；染色质免疫共沉淀(ChIP，ChromatinImmunoprecipitation)进一步证实在未诱导的P19CL6细胞，Foxo3a可以结合到Dok5上游启动子区的FHBE，而DMSO诱导6天和12天的P19CL6细胞中Foxo3a不能结合Dok5的FHBE。 已知用DMSO诱导P19CL6细胞向心肌细胞分化过程中PI3K/Akt通路是激活的，因此我们推测Foxo3a在该过程中发生磷酸化转位到胞浆，不再结合Dok5上游启动子区的FHBE是Dok5mRNA表达升高的原因之一。为了证实这个设想，我们首先通过免疫荧光实验观察到P19CL6向心肌细胞分化过程中存在Foxo3a从胞核到胞浆的转位，WesternBlot的方法也证实该过程中Foxo3a的磷酸化水平明显升高。 为了进一步确证Foxo3a对Dok5基因表达调控的作用，我们在P19CL6细胞系中使用含有Dok5启动子区的报告基因系统检测了Foxo3a对其转录活性的影响，同时观察了野生型和磷酸化位点突变型Foxo3a(triplemutant，TM即Akt磷酸化位点T32A/S253A/S315A突变的Foxo3a)在P19CL6细胞和293ET细胞中的分布情况。结果发现过表达野生型Foxo3a对报告基因活性没有明显的抑制作用，它在胞浆胞核广泛分布，以胞浆分布为主；突变型的Foxo3a可以明显抑制Dok5报告基因的活性，以胞核分布为主。这些结果表明，Foxo3a对Dok5基因的转录起到抑制作用，这种抑制作用随着Foxo3a发生磷酸化，定位到胞浆而减弱甚至消失。 为了检验上述结论，我们用Foxo3a的siRNA抑制Foxo3a的内源性表达，发现Dok5mRNA的表达水平增高，该结果进一步说明Foxo3a对Dok5基因表达起到负调控作用。 以上研究结果初步证明，Foxo3a对Dok5的转录起重要的抑制作用。当用1％DMSO刺激P19CL6细胞向心肌细胞分化时，PI3K/Akt通路活化，磷酸化Foxo3a使其定位到胞浆中，从而使Foxo3a不能结合Dok5启动子区的FHBE，减弱了Foxo3a对Dok5的转录抑制作用，Dok5的表达水平增高。 在完成上述工作的基础上，我们还用蛋白质组学的方法寻找P19CL6细胞向心肌细胞分化前后差异表达的蛋白。通过双向电泳发现了17个差异表达的蛋白点，经过基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱分析，最终鉴定出16个差异表达的蛋白点。其中，诱导分化后表达上调的有13个蛋白点，分化后表达下调的有3个蛋白点。对这些差异蛋白的分析结果表明，它们在分化过程中与能量代谢、信号传导、细胞骨架形成等有关。