丁酸钠和β-羟丁酸钠缓解瘤胃细菌细胞壁成分对奶牛炎症和泌乳影响的研究

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为了提高产奶量和经济效益,在奶牛生产中常使用高精粗比的饲粮,以增加泌乳期间的营养供应。然而高精料饲粮易诱发亚急性瘤胃酸中毒(SARA)。在SARA发生和发展过程中,瘤胃微生物区系和丰度发生改变,大量的细菌细胞壁成分被释放到瘤胃中。脂多糖(LPS)因其强烈的致炎活性受到广泛关注。高精料饲粮模式下,瘤胃和血浆中LPS浓度大量增加,进而诱发奶牛系统性和局部炎症。同为细菌细胞壁成分的肽聚糖(PGN)和脂磷壁酸(LTA)也具有一定的促炎活性,高精料饲粮模式下,它们在瘤胃和血浆中的浓度如何变化以及对乳腺炎症和泌乳有何影响,需要进行研究。此外,LPS、PGN和LTA单独和联合刺激又会对乳腺炎症产生什么不同影响,值得深入探讨。丁酸钠作为组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂,将其添加在反刍动物高精料饲粮中可缓解SARA,并减轻LPS和γ-D-谷氨酸-内消旋-二氨基庚二酸(i E-DAP,PGN核心结构)诱导的炎症。丁酸被瘤胃壁吸收后迅速代谢生成的β-羟丁酸,同样作为HDAC抑制剂。β-羟丁酸作为乳脂合成的前体,既能促进泌乳,还具有一定的抗炎活性。将β-羟丁酸钠添加在高精料饲粮中,是否比添加丁酸钠效果更好,以及相关的调控机制均有待探讨。鉴于以上有待研究的问题,我们首先研究PGN、LTA和LPS单独及联合刺激对牛乳腺上皮细胞(b MECs)转录组、炎症和组蛋白乙酰化的影响;其次在PGN、LTA和LPS联合刺激的同时,添加HDAC抑制剂丁酸钠和β-羟丁酸钠,探究它们对b MECs炎症和组蛋白乙酰化的影响;最后将丁酸钠和β-羟丁酸钠添加在奶牛高精料饲粮中,揭示它们对奶牛炎症和泌乳的影响。1.PGN和LTA单独及联合刺激(MIX)对牛乳腺上皮细胞转录组、炎症和组蛋白乙酰化的影响本试验采用RNA转录组测序和生物信息学分析技术,研究PGN和LTA单独及联合刺激(MIX)对b MECs转录组的影响,并重点关注它们对炎症及组蛋白乙酰化的调控作用,为诠释革兰氏阳性菌细胞壁成分在高精料饲粮损害乳腺健康中的作用提供理论依据。本试验采用单因素随机试验设计,分为4组,每组6个重复。将bMECs接种到6孔板中,待诱导分化生长到60%汇合时各组分别更换新鲜培养基(CON组)、含30μg/m L PGN的新鲜培养基(PGN组)、含30μg/m L LTA的新鲜培养基(LTA组)、含30μg/m L PGN和LTA的新鲜培养基(MIX组),孵育24 h。结果显示:(1)各组高质量clean reads数和已知基因数均按照PGN组<LTA组<MIX组的顺序递增。(2)与CON组相比,另外三组表达上调和下调的差异基因(DEGs)数按PGN组<LTA组<MIX组的顺序递增,且这些DEGs均主要富集在细胞因子活性GO条目上以及细胞因子?细胞因子受体相互作用通路上。(3)用RT-q PCR法测定了6个炎性因子的相对m RNA表达,其与RNA测序结果基本一致。(4)促炎细胞因子(IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α)和趋化因子(CXCL1和CXCL6)表达按CON组<PGN组<LTA组<MIX组的顺序升高。(5)与CON组相比,PGN组、LTA组和MIX组的组蛋白H3乙酰化水平以及组蛋白乙酰化酶(HAT)活性都显著下降。综上,PGN对b MECs转录组和炎性反应的影响较LTA弱,两者联合刺激更强烈地影响了基因转录,使DEGs数量和表达水平均增加,进而加剧了炎性反应,呈加和效应。PGN和LTA单独及联合刺激通过抑制HAT活性降低了组蛋白H3乙酰化。2.LPS及PGN、LTA和LPS联合刺激(PLL)对牛乳腺上皮细胞转录组、炎症和组蛋白乙酰化的影响本试验同样利用转录组测序和生物信息学分析技术,进一步分析LPS以及PGN、LTA和LPS联合刺激(PLL)对b MECs转录组的影响,并重点关注它们对炎症及组蛋白乙酰化的调控作用,为更全面的诠释瘤胃细菌细胞壁成分在高精料饲粮损害乳腺健康中的作用提供理论依据。本试验采用单因素随机试验设计,分为3组,每组6个重复。将b MECs接种到6孔板中,待诱导分化生长到60%汇合时各组分别更换新鲜培养基(CON组)、含0.1μg/m L LPS的新鲜培养基(LPS组)、含30μg/m L PGN和LTA以及0.1μg/m L LPS的新鲜培养基(PLL组),孵育24 h。结果显示:(1)各组基因表达水平按照CON组<LPS组<PLL组的顺序递增。(2)与CON组相比,LPS组表达上调和下调的DEGs数均少于PLL组;LPS组和PLL组的DEGs都主要富集在TNF、NOD样受体、Toll样受体和NF-κB等信号通路中;LPS组的DEGs富集在这些通路上的数量要少于PLL组;LPS诱导的免疫相关DEGs的数量和表达量都比PLL的少。(3)用RT-q PCR测定的6个炎性因子的相对m RNA表达与RNA测序结果基本一致。(4)促炎细胞因子(IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α)和趋化因子(CXCL1和CXCL6)表达按照CON组<LPS组<PLL组的顺序递增。(5)与CON组相比,LPS组和PLL组的组蛋白H3乙酰化水平和HAT活性都显著下降。综上,PGN、LTA和LPS联合刺激比LPS更强烈的影响了b MECs基因转录,使DEGs数量和表达水平均增加,进而加剧了炎性反应,呈加和效应。LPS和联合刺激均通过抑制HAT活性降低了组蛋白H3乙酰化。3.丁酸钠和β-羟丁酸钠对PLL刺激时牛乳腺上皮细胞炎症和组蛋白乙酰化的影响本试验用组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂丁酸钠和β-羟丁酸钠分别处理b MECs,观察它们在缓解PLL导致的炎性反应及组蛋白乙酰化修饰过程中的作用,为控制高精料饲粮模式下瘤胃细菌细胞壁成分对奶牛乳腺健康的不利影响提供理论依据和调控方法。本试验采用单因素随机试验设计,分为4组,每组6个重复。将b MECs接种到6孔板中,待诱导分化生长到60%汇合时各组分别更换新鲜培养基(CON组)、含30μg/m L PGN和LTA以及0.1μg/m L LPS的新鲜培养基(PLL组)、含1 m M丁酸钠的PLL组培养基(PLLSB组)、含1 m Mβ-羟丁酸钠的PLL组培养基(PLLHB组),孵育24 h。结果显示:(1)促炎细胞因子(IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α)表达按CON组<PLL组<PLLSB组的顺序递增。与PLL组和PLLSB组相比,PLLHB组的促炎细胞因子表达显著下降。(2)与CON组相比,PLL组的组蛋白H3乙酰化水平和HAT活性都显著下降。组蛋白H3的乙酰化水平按PLL组<PLLHB组<PLLSB组的顺序递增。(3)HDAC活性按PLL组>CON组>PLLHB组>PLLSB组的顺序递减。综上,丁酸钠增强了细菌细胞壁组分诱发的炎性反应,而β-羟丁酸钠发挥相反的作用,也许是因为与β-羟丁酸钠相比,丁酸钠更强烈的抑制了HDAC活性进而极大的促进了组蛋白H3乙酰化。4.丁酸钠和β-羟丁酸钠对高精料饲粮模式下奶牛炎症和泌乳的影响本试验将丁酸钠和β-羟丁酸钠分别添加在奶牛高精料饲粮中,首先比较它们对生产性能的影响,其次探讨它们对瘤胃和血浆中游离细菌细胞壁成分(LPS、PGN和LTA)的影响,最后揭示它们对系统性炎症和乳腺炎症的影响,旨在缓解高精料饲粮对奶牛健康和泌乳的不利影响。本试验采用完全随机试验设计,选取80头处于泌乳中期的健康中国荷斯坦牛,随机分为4组,每组20头。四组分别为:(1)低精料组(LC组,饲粮精粗比为4:6);(2)高精料组(HC组,饲粮精粗比为6:4);(3)丁酸钠组(HCSB组,HC组的基础上添加饲粮干物质1%的丁酸钠);(4)β-羟丁酸钠组(HCHB组,HC组的基础上添加饲粮干物质1%的β-羟丁酸钠)。预饲期2周,正试期5周。结果显示:(1)日粮、时间以及日粮与时间互作显著影响干物质采食量(DMI)、4%标准乳产奶效率和乳成分。日粮趋于影响产奶量(p=0.06),HCSB组的产奶量在第三周达到峰值后一直维持在峰值水平。HCSB组和HCHB组的乳脂肪显著高于LC组和HC组。(2)HC组瘤胃液p H值显著低于其它三组;HCSB组瘤胃液p H值显著高于HCHB组。与LC组相比,HC组瘤胃液和血浆中的细菌细胞壁成分(LPS、PGN和LTA)都显著升高;HCSB组瘤胃液和血浆中的细菌细胞壁成分都低于HC组和HCHB组,仅瘤胃液中的PGN差异不显著;HC组与HCHB组之间的细菌细胞壁成分差异不显著。(3)与LC组相比,HC组血浆中的促炎细胞因子(IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α)和急性期蛋白(LBP、SAA、CRP和Hp)都显著升高;与HC组相比,HCSB组的4个促炎细胞因子、CRP和Hp以及HCHB组的IL-6和Hp都显著降低;HCSB组的IL-1β较HCHB组的显著降低。(4)与LC组相比,HC组外周血中白细胞数(淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞)显著增加;与HC组相比,HCSB组的白细胞总数、淋巴细胞数和单核细胞数以及HCHB组的白细胞总数和淋巴细胞数都显著减少。日粮和时间显著影响牛奶中体细胞数(SCC);从第二周开始,HC组的SCC就比另外三组多。(5)与LC组相比,HC组的血酮显著下降;HCSB组的血酮差异不显著;HCHB组的血酮显著升高。血酮按HC组<HCSB组<HCHB的顺序递增。(6)与LC组相比,HC组乳腺细胞的模式识别受体(TLR4、NOD1和PGRP2)和促炎细胞因子(IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α)表达都显著增加;与HC组相比,HCSB组乳腺细胞的模式识别受体和促炎细胞因子以及HCHB组的NOD1、PGRP2、IL-1β、IL-6和IL-8表达都显著减少;与HCSB组相比,HCHB组乳腺细胞的TLR4、IL-8和TNF-α表达显著增加。综上,丁酸钠和β-羟丁酸钠都能缓解高精料饲粮对奶牛机体健康和泌乳的不利影响,且丁酸钠的作用效果强于β-羟丁酸钠,也许是因为抑制了高精料饲粮引起地瘤胃和血浆中细菌细胞壁成分(LPS、PGN和LTA)增多。综合以上试验结果表明:(1)PGN、LTA和LPS对b MECs转录组和炎性反应的影响呈加和效应,联合刺激诱发了更强烈的基因转录,使差异基因数量和表达水平均增加,进而加剧了炎性反应。(2)PGN、LTA、LPS以及它们联合刺激均能降低HAT活性和组蛋白H3乙酰化水平,不具加和效应。(3)丁酸钠在体外增强了细菌细胞壁成分(LPS、PGN和LTA)诱发的炎性反应,而β-羟丁酸钠发挥相反的作用,因为丁酸钠比β-羟丁酸钠更强烈地影响了HDAC活性和组蛋白H3乙酰化。(4)丁酸钠在体内能减轻高精料饲粮对奶牛机体健康和泌乳的不利影响,且效果优于于β-羟丁酸钠,因为显著减少了瘤胃和血浆中游离细菌细胞壁成分(LPS、PGN和LTA)。
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