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目的:
砷广泛存在于自然界中,包括无机砷和有机砷。人类可以通过环境、职业暴露或者使用含砷药物而接触到无机砷,长期砷暴露可引发多种疾病,大量流行病学调查资料显示:砷污染是暴露人群的2型糖尿病发生的重要因素之一。但砷导致2型糖尿病发生的机制仍不明确,目前,医学界认为氧化应激可能是造成2型糖尿病胰岛β细胞损伤的重要病理机制之一,而砷中毒发病机制的重要理论就是氧化应激学说,因此砷暴露导致胰岛β细胞毒性损伤可能与氧化应激有关。核转录因子Nrf2(Nuclear factor-erythroid2-related factor2)属于CNC碱性亮氨酸拉链蛋白家族成员,是启动细胞抗氧化反应的主要调控因子。因此在本研究中,首先,应用稳定的Nrf2基因沉默小鼠胰岛β细胞MIN6和从Nrf2基因敲除小鼠中分离的胰岛,在急性高剂量砷暴露的条件下,应用光学显微镜、MTT、流式细胞仪等实验技术观察砷暴露导致的细胞毒性在Nrf2基因沉默MIN6细胞和Nrf2基因敲除的胰岛中的变化;其次,应用qReal-time RT-PCR和Western Blotting等实验技术检测砷对Nrf2及其ARE目的基因表达的影响。从而阐明Nrf2在砷诱导的小鼠胰岛β细胞和分离的胰岛抗氧化反应和细胞毒性过程中的作用机制,为预防和治疗砷致糖尿病提供理论依据。
实验方法
1、细胞培养:小鼠胰岛β细胞系MIN6
2、建立Nrf2基因沉默小鼠胰岛β细胞系MIN6
3、通过MTT法检测急性砷暴露对Scr和Nrf2-KD细胞的急性细胞毒性损伤情况
4、利用流式细胞仪和Western Blotting检测急性砷诱导Scr和Nrf2-KD细胞的凋亡情况
5、利用相差显微镜观察急性砷暴露对WT和Nrf2-KO小鼠胰岛毒性损伤情况
6、利用qReal-time RT-PCR和Western Blotting检测急性砷暴露对Nrf2的基因和蛋白的表达情况
7、利用qReal-time RT-PCR检测急性砷暴露对ARE目的基因的表达情况
8、利用qReal-time RT-PCR检测急性砷暴露对Nrf2基因敲除的小鼠胰岛Nrf2和ARE目的基因的表达影响
9、应用统计软件Graphpad Prism5进行数据处理分析与制图
实验结果:
1、建立Nrf2基因沉默小鼠胰岛β细胞系MIN6
qReal-time RT-PCR和Western Blotting结果显示:Nrf2基因沉默(Nrf2-KD)细胞Nrf2的mRNA和蛋白表达水平均低于Scr细胞。
2、急性砷暴露对Scr和Nrf2-KD细胞的急性细胞毒性
应用2、4、6、8、10、12、14、16μM的亚砷酸钠和0.5、1、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0μM MMA3+处理Scr和Nrf2-KD细胞24 hrs,Scr和Nrf2-KD细胞活性均随着亚砷酸钠和MMA3+浓度的增高而逐渐变低,Nrf2-KD细胞对亚砷酸钠和MMA3+的急性毒性比Scr细胞更敏感。
3、流式细胞仪检测急性砷诱导Scr和Nrf2-KD细胞凋亡
应用6、8和10μM的亚砷酸钠处理Scr和Nrf2-KD细胞24 hrs,应用流式细胞仪检测细胞凋亡情况,发现Nrf2-KD细胞凋亡比例较同剂量组Scr组增高。
4、Western Blotting检测急性砷诱导Scr和Nrf2-KD细胞caspase-3的表达
应用2、4、6、8和10μM的亚砷酸钠处理Scr和Nrf2-KD细胞24 hrs,WesternBlotting检测cleaved-caspase-3,结果显示:Nrf2-KD细胞表达量明显高于同剂量组Scr细胞。
5、急性砷暴露对tBHQ预处理的Scr和Nrf2-KD细胞的毒性损伤
Scr细胞被50μM tBHQ预处理6hrs后,再经不同剂量(4、6、8、10、12μM)的亚砷酸钠处理24hrs,结果可见经tBHQ预处理后的Scr细胞活性上调,而Nrf2-KD细胞中未见到细胞活性有改变。
6、急性砷暴露对Nrf2基因敲除的小鼠胰岛的毒性损伤
分离的胰岛在体外培养48hrs后,分三个实验组:对照组、iAS3+20μM染毒组、iAS3+50μM染毒组;每个实验组均由各100个随机挑选的WT小鼠胰岛组和Nrf2-KO小鼠胰岛组构成,在不同时间点(8、12、16、24hrs)用倒置显微镜观察每个实验组存留的胰岛数量并照相。统计结果显示:Nrf2-KO小鼠胰岛对亚砷酸钠毒性损伤比WT更敏感。
7、急性砷暴露对小鼠胰岛β细胞Nrf2基因与蛋白表达的影响
Scr和Nrf2-KD细胞暴露于不同浓度的亚砷酸钠(2、4、6、8和10μM)6hrs或4μM亚砷酸钠不同时间点(2、6、12、18、24hrs),结果显示:亚砷酸钠对Scr细胞总Nrf2和核内Nrf2蛋白水平的激活作用存在明显的时间和剂量效应,但对Nrf2的mRNA表达影响不显著。Nrf2-KD细胞与Scr细胞相比时间和剂量效应不显著。
8、急性砷暴露致小鼠胰岛β细胞ARE目的基因表达的影响
Scr和Nrf2-KD细胞暴露于不同浓度的亚砷酸钠(0、2、4、6、8和10μM)6hrs或4μM亚砷酸钠不同时间点(0、2、6、12、18、24hrs),实验结果表明,亚砷酸钠对ARE目的基因(Nqol、Hmox-1、Gclc、Srx)激活作用存在明显的时间和剂量效应,Nrf2-KD细胞与Scr细胞相比时间和剂量效应不显著。
9、急性砷暴露对Nrf2基因敲除的小鼠胰岛Nrf2和ARE目的基因的表达影响
WT和Nrf2-KO小鼠胰岛暴露于5μM亚砷酸钠6hrs,结果表明,生理条件下或亚砷酸钠染毒,Nrf2-KO小鼠胰岛均未见Nrf2表达。在正常生理条件下,ARE目的基因Nqol、Hmox-1、Gclc、和Srx在Nrf2-KO小鼠胰岛中表达均低于WT小鼠胰岛,亚砷酸钠染毒后,WT小鼠胰岛的ARE目的基因显著升高,而Nrf2-KO小鼠胰岛ARE目的基因表达增高不显著。
结论:
1、Nrf2基因沉默的小鼠胰岛β细胞MIN6对急性砷暴露诱导的细胞毒性损伤更敏感。
2、Nrf2基因敲除的小鼠胰岛对急性砷暴露诱导的细胞毒性损伤更敏感。
3、Nrf2基因沉默的小鼠胰岛β细胞MIN6明显降低了抵抗急性砷暴露诱导的氧化应激反应的能力
4、Nrf2基因敲除的小鼠胰岛显著减弱了抵抗急性砷暴露诱导的氧化应激反应的能力