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目的观察健脾通里中药“芪黄煎剂”对模型大鼠肠黏膜紧密连接蛋白的影响,并探讨其作用机制。方法1.造模和分组方法采用胃切除手术方案建立大鼠模型。将90只Wistar雄性大鼠大鼠按体质量由低到高编号,然后用随机数字表法将其均分为6组,每组15只,分别为正常组,假手术组(仅腹壁切开,未切除胃),营养组,芪黄煎剂高、中、低剂量组。2.各组干预方法正常组与假手术组造模后正常饮食饮水,营养组和中药芪黄煎剂组术后禁食,营养组每天通过造模后的硅胶管注射肠内营养液120KJ/kg.d,中药芪黄煎剂组注射肠内营养液+中药煎剂,芪黄煎剂组高、中、低剂量分别为20,10,5g/kg.d。共7d。3.观察的指标及检测方法3.1健脾通里中药(芪黄煎剂)对肠黏膜上皮间紧密连接形态结构的影响:通过建立胃切除手术创伤大鼠模型,给予小肠内滴注芪黄煎剂,在透射电镜下观察紧密连接的形态结构,并测量其宽度(um)。3.2健脾通里中药对Occludin、Claudin、ZO-1m RNA表达的调节:通过实时荧光定量RT-PCR方法,检测其m RNA表达水平,观察Occludin、Claudin、ZO-1基因转录情况。3.3健脾通里中药对紧密连接分子Occludin、Claudin、ZO-1分布和定位的调节:在荧光显微镜下,应用免疫荧光方法检测Occludin、Claudin、ZO-1在肠黏膜上皮细胞内的分布位置,三者是否存在共定位及其共定位强度。以此评价三者是否能够在细胞边缘近胞膜处共同分布、分布强度、彼此互相结合构成紧密连接。4.统计学方法所有计量资料实验数据都以均数±标准差(`x±s)表示,两组以上数据分析比较采用单因素(AVOVA)方差分析,并且用SPSS 22.0软件进行处理,P<0.05认为差异具有统计学意义。结果1.肠黏膜紧密连接的形态结构1.1.电镜下的形态和结构所见:各组间紧密连接都可在电镜下显示,紧密连接位于上皮细胞侧面接近游离面的顶端,呈狭窄的带状(焊接线或嵴线);紧密连接处可见细胞膜表面不连续的融合点或吻合点,其连续性和完整性各组不同,总体上来说,正常组其紧密连接连续性和完整性较手术组好。相比较营养组,中药组细胞膜表面紧密连接完整性和连续性相对较好。1.2.透射电镜下测量肠黏膜上皮细胞紧密连接宽度,正常组、假手术组、营养组和中药芪黄煎剂低、中、高剂量组紧密连接平均宽度分别为0.7668±0.1276um,0.5265±0.1020um,0.1944±0.0075um,0.2930±0.0122um,0.3114±0.0470um,0.3710±0.263um。与正常组比较,假手术组、营养组和中药组,大鼠肠黏膜上皮细胞紧密连接遭到破坏,紧密连接宽度变窄(P<0.01)。与营养组比较,运用三个剂量组的中药治疗一周后,大鼠肠黏膜紧密连接宽度都得到较好的修复和保护(P<0.01)。但与假手术组比较,中药各剂量组大鼠肠黏膜紧密连接宽度都尚未恢复至假手术组水平(P<0.01)。2.紧密连接蛋白(Monula Occludin-1)ZO-1、闭合蛋白(Claudin-1)、咬合蛋白(Occludin)m RNA表达2.1与正常组比较,假手术组、营养组和中药组Claudin-1 m RNA表达显著升高(P<0.01);与假手术组比较,营养组和中药组Claudin-1 m RNA表达显著升高(P<0.01);与营养组比较,中药芪黄煎剂低、中、高剂量组Claudin-1 m RNA表达逐渐升高(P<0.01)。2.2与正常组比较,假手术组、营养组和中药组Occludin m RNA和ZO-1 m RNA表达显著降低(P<0.01);与营养组比较,中药芪黄煎剂低、中、高剂量组Occludin m RNA和ZO-1 m RNA表达逐渐升高(P<0.01);与假手术比较,中药组Occludin m RNA和ZO-1 m RNA表达虽升高,但尚未到假手术组水平组(P<0.01)。3.紧密连接分子Occludin、Claudin-1、ZO-1分布和定位和共定位强度3.1激光共聚焦荧光显微镜下观察三种蛋白分子在肠黏膜上皮细胞内分布及共定位。荧光显微镜下我们可以直接看出,Occludin与Claudin-1蛋白在上皮细胞膜表面表达,而ZO-1蛋白分子在胞质内表达。3.2通过在荧光显微镜下计数各视野内切片中共定位的阳性细胞数目来确定共定位强度。正常组、假手术组、营养组和中药芪黄煎剂低、中、高剂量组Claudin-1和ZO-1共定位阳性细胞数分别是155±8个、132±10个、68±9个、80±5个、90±7个,111±8个,Occludin和ZO-1共定位阳性细胞数分别为150±9个、129±7个、70±10个、83±6个、93±7个、114±8个。与正常组比较,营养组和中药组蛋白之间共定位强度明显减弱(P<0.01)。与营养组比较,运用中药后,三种剂量的中药组蛋白之间共定位强度都得到加强(P<0.01)。与假手术组比较,三种剂量的中药组蛋白之间共定位强度都未恢复至假手术组水平(P<0.01)。结论1.健脾通里中药芪黄煎剂对胃切除手术创伤引起的肠黏膜上皮细胞间紧密连接破坏具有保护作用,能够使受损的紧密连接连续性和完整性得到较好的恢复,能够使受损的肠黏膜上皮细胞间紧密连接宽度增加。2.中药芪黄煎剂能够促进Occludin、Claudin-1和ZO-1分子m RNA的表达。3.Occludin、Claudin-1在细胞膜表面分布,ZO-1在细胞质内分布,Claudin-1和Occludin与ZO-1之间存在共定位,中药能够加强Occludin、Claudin-1和ZO-1分子在近肠上皮细胞处分布强度和彼此之间互相结合。