基于NLRP3信号通路探讨江南卷柏黄酮治疗痛风的作用机制

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江南卷柏是卷柏科植物江南卷柏Selaginella moellendorfii Hieron.的干燥全草,始载于宋代《本草图经》,味辛、微甘,性平,具有清热解毒,利尿通淋,活血消肿,止血退热的功效,可用于多种急慢性炎症。已知的化合物绝大多数是黄酮类化合物,且具有多种生物活性,是江南卷柏特征成分。本课题组前期研究表明,江南卷柏具有抗痛风作用,但其治疗痛风的作用机制尚不清楚。因此,本文拟在前期研究基础上,运用整体动物模型研究江南卷柏黄酮的抗痛风作用,并从分子和细胞水平和动物水平探讨总黄酮和主要黄酮成分抗痛风的作用机制。目的:通过分析江南卷柏的主要成分,筛选江南卷柏不同极性部位的抗炎活性,确认其活性部位并进一步研究其部位中总黄酮及主要黄酮类成分的体外抗炎活性和体内抗痛风作用,并检测其对NLRP3炎症小体活化的影响,探讨江南卷柏黄酮抗痛风的作用机制。方法:(1)利用UPLC-MS技术等对江南卷柏水取物进行成分分析和鉴定。(2)(1)建立脂多糖(LPS)诱导的小鼠RAW 264.7细胞炎症模型,筛选江南卷柏不同提取部位和黄酮单体成分的体外抗炎活性,包括穗花杉双黄酮、芹菜素、罗布斯塔双黄酮-4’-甲醚、芹菜素-6,8-二-C-β-D-吡喃葡萄糖苷(YI)、芹菜素-6-C-β-D-吡喃葡萄糖-8-C-β-D吡喃木糖苷(YII)、芹菜素-6-C-β-D-吡喃木糖-8-C-β-D吡喃葡萄糖苷(YIII)。检测指标包括:采用MTT法检测细胞毒性,Griess法检测对NO分泌量的影响,ELISA法检测IL-1β分泌量。(2)建立尿酸钠(MSU)诱导的小鼠急性痛风性关节炎模型,筛选江南卷柏总黄酮、芹菜素、穗花杉双黄酮等的体内抗痛风活性。检测指标包括:采用游标卡尺测量不同组别小鼠足垫肿胀情况,ELISA法检测足垫组织中IL-1β水平,HE染色法观察足垫组织病理学改变。(3)用MSU诱导LPS致敏的THP-1细胞,建立NLRP3炎症小体活化的细胞炎症模型。采用CCK-8法测定不同浓度江南卷柏黄酮的细胞毒性,乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测对LDH释放的影响,PI染色法检测细胞膜完整性,扫描电镜观察细胞表面形态,ELISA法检测炎症因子(IL-1β、TNF-α)的分泌量,RT-PCR技术检测炎症相关基因(IL-1β、TNF-α、Caspase-1、NLRP3)的表达,免疫荧光检测ASC蛋白斑点和NLRP3蛋白表达量,Western Blot法检测NLRP3信号通路相关蛋白(IL-1β/pro-IL-1β、Caspase-1/pro-caspase-1)的表达。结果:(1)经过UPLC-MS分析测定发现江南卷柏水提物中含有腺苷、鸟苷、翠云草苷B、槲皮素、新卷柏酸、木犀草素、柯伊利素、5-羧甲基-4’-羟基黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、芹菜素-6,8-二-C-β-D-吡喃葡萄糖苷、芹菜素-6-C-β-D-吡喃葡萄糖-8-C-β-D-吡喃木糖苷、芹菜素-6-C-β-D-吡喃木糖-8-C-β-D-吡喃葡萄糖苷、银杏黄素、白果黄素、芹菜素等多种化合物,主要为黄酮类和核苷类等化合物,其中黄酮类成分有9个,为卷柏属植物共有成分。(2)LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型结果表明:(1)江南卷柏乙酸乙酯部位和正丁醇部位能够明显抑制NO分泌,而水部位则无明显作用。(2)对活性更强的江南卷柏乙酸乙酯部位,经D101大孔树脂分离纯化,得到江南卷柏总黄酮,江南卷柏总黄酮抑制NO分泌的EC50值为40.47μg/mL,抑制IL-1β分泌的EC50值为38.43μg/mL。(3)江南卷柏总黄酮、穗花杉双黄酮、芹菜素和罗布斯塔双黄酮-4’-甲醚对NO和IL-1β等炎症因子的分泌有明显的抑制作用,而黄酮苷类化合物无明显的影响,抑制NO分泌的EC50值分别为40.47μg/mL,116.0μM,16.71μM,15.21μM,抑制IL-1β分泌的EC50值分别为38.43μg/mL,25.90μM,9.49μM,28.24μM。小鼠急性痛风性关节炎模型结果表明:与正常组相比,造模后4h,模型组小鼠足垫厚度显著增加(P<0.01),并在24h时足垫厚度达到最大值,同时足垫组织中的IL-1β水平明显增加(P<0.01),HE染色可观察到大量炎性细胞浸润。与模型组相比,江南卷柏总黄酮、穗花杉双黄酮、芹菜素给药组能够显著降低小鼠足垫厚度(P<0.01或P<0.05),降低足垫组织中IL-1β水平(P<0.01或P<0.05),减少炎性细胞的浸润。(3)MSU诱导LPS致敏的THP-1细胞构建体外痛风模型,对江南卷柏黄酮的抗痛风作用机制分析。结果表明:与模型组相比,江南卷柏总黄酮,穗花杉双黄酮,罗布斯塔双黄酮-4’-甲醚能够明显抑制乳酸脱氢酶(LDH)的释放(P<0.01或P<0.05),剂量依赖性的降低IL-1β和TNF-α水平(P<0.01或P<0.05),并能够抑制IL-1β、TNF-α、Caspase-1和NLRP3 mRNA的表达。同时江南卷柏总黄酮能够改善细胞表面形态,减少PI染色细胞数;抑制ASC寡聚化,使ASC斑点减少,NLRP3蛋白荧光强度减弱,降低IL-1β/pro-IL-1β、Caspase-1/pro-caspase-1蛋白表达。结论:江南卷柏黄酮具有较好的体内外抗痛风活性,作用机制与其保护细胞膜完整性,改善细胞形态,降低炎症因子释放水平,调控NLRP3/ASC/Caspase-1轴上相关蛋白和mRNA的表达等有关。
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