随着人口老龄化，阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）已成为严重危害人类健康的四大杀手疾病之一。由于AD发病机制十分复杂，病因至今不明，亦无理想的防治药物问世，因此，给其防治带来了很大的困难。而越来越多的研究提示，AD的发生发展过程涉及多系统、多环节结构和功能的异常，是典型的多因素复杂疾病，针对单一靶点的防治措施难以取得满意疗效，多靶点综合干预是提高AD防治水平的重要策略。因此，寻找、研究并确立一组或几组与AD脑内病理改变及认知功能障碍密切相关的、且具有相互补充与协同关系的“组合靶标”，将为AD防治药物的筛选和发现提供新的筛选靶标体系，将大大提高AD防治药物的研究和开发水平。中药，尤其是中药复方在防治AD中显示出明显特色和优势。有资料显示，我国和日本等国家在防治AD的临床实践中均广泛使用了多种中药复方，取得了明显疗效。目前普遍认为，中药复方的药效是由方中所含的多种药效成分，通过多途径、多环节和多靶点作用而产生的综合效果，从这一点上看，中药复方对于防治AD这类多因素复杂疾病而言，与作用靶点相对单一的化学药物相比具有明显的优势和特色。事实上，我国和日本等国家在防治AD中广泛使用的中药复方如当归芍药散、开心散、六味地黄汤、八味地黄汤、黄连解毒汤、调心方、钩藤散等，不但在治疗AD方面取得良好的临床疗效，实验药理学研究结果也表明这些中药复方对于AD或学习记忆功能障碍模型动物的学习记忆功能具有改善作用，提示它们发挥抗AD作用是具有一定药理学基础的。从中医药分类看，这些中药复方的功能主治不尽相同，如补肾、活血化瘀、清热解毒等，提示它们发挥药效的靶点和作用机理可能有所不同。因此，从这些中药中选择几种疗效明确的代表方剂做为工具，研究和探索它们发挥益智作用的环节或靶点有望为防治AD药物筛选与研究新靶标的发现提供线索，同时还可能为从药理学角度研究和阐述AD病理生理学过程和发病机制提供新的线索。基于上述原因，本实验室在国家重点基础研究发展规划项目的资助下，选择包括六味地黄汤、八味地黄汤、当归芍药散、调心方及黄连解毒汤在内的几种功能主治不同的中药复方作为工具药物，以与AD具有相似病理特点的快速老化模型小鼠（senescence-accelerated mouse，SAM）P8亚系（SAMP8）为模型，通过实验治疗并结合抑制消减杂交、基因芯片和蛋白质组学等技术方法从与学习记忆或认知功能密切相关的脑区寻找药物反应基因和蛋白，旨在通过分析与比较，确定上述中药复方发挥抗AD作用的主要环节或靶点，并据此提出并通过验证确定一组或几组AD防治药物筛选和评价的“组合靶标”，为新型抗AD药物筛选和评价体系的建立奠定基础。本文是上述研究的重要组成部分。其主要研究内容在于，首先应用学习记忆行为实验初步验证清热解毒方剂黄连解毒汤对SAMP8学习记忆能力的改善作用，进而应用蛋白质组学技术，观察黄连解毒汤作用下海马这一与AD病理变化及学习记忆损害密切相关脑区蛋白表达的变化，并通过对其中的差异蛋白进行质谱鉴定和生物信息学分析，初步获得海马中的黄连解毒汤反应蛋白，为揭示黄连解毒汤作用环节或作用靶点提供依据。同时通过与六味地黄汤、八味地黄汤和当归芍药散进行分析与比较，获得黄连解毒汤与这三个方剂的共同反应蛋白和各自特异性的反应蛋白，为抗AD药物筛选和评价“组合靶标”的提出和后续的靶标验证工作提供线索。一、黄连解毒汤对12月龄SAMP8学习记忆行为的影响SAM包括快速老化的P系（SAM-prone，SAMP）和R系（SAM-resistant，SAMR）两大系。其中SAMP8亚系的显著特征是中枢学习记忆功能随增龄快速衰退，其脑内具有多种与AD相似的病理变化如APP代谢异常及β淀粉样蛋白含量的升高等，且其对药物治疗具有良好的反应，因此被认为是研究AD发生机理及其防治药物的较为理想的动物模型。SAMR1亚系有着相对正常的生存期，常被用做正常对照。本研究以SAMP8作为学习记忆障碍模型，通过Morris水迷宫实验和跳台实验观察了黄连解毒汤（HLJDT）对SAMP8空间学习记忆能力和被动回避能力的影响。Morris水迷宫实验结果表明，与同龄SAMR1相比，SAMP8在定位航行实验中的逃避潜伏期明显延长，空间探索实验中的目标穿环次数明显下降，灌胃给予HLJDT（2.5g／kg），连续2个月，可明显缩短SAMP8的逃避潜伏期，并且可明显提高目标穿环次数。跳台实验结果表明，训练期间SAMP8逃避电击成功率低于SAMR1，灌胃给予HLJDT后，提高了SAMP8逃避电击成功率；测试阶段SAMP8的跳台错误次数高于SAMR1，灌胃给予HLJDT后跳台错误次数明显下降。结果提示SAMP8被动回避反应能力降低，HLJDT对其具有一定的改善作用。二、黄连解毒汤对12月龄SAMP8海马蛋白表达的影响（一） 12月龄SAMR1和SAMP8海马差异蛋白的分离和鉴定1 SAMR1和SAMP8海马蛋白表达谱的建立及差异分析首先采用双向凝胶电泳结合图像分析技术观察12月龄SAMR1和SAMP8的海马蛋白表达谱，结果表明，与SAMR1相比，SAMP8海马中表达存在明显差异的蛋白点有29个，其中8个蛋白点显著上调，21个蛋白点显著下调。2 SAMR1和SAMP8海马差异蛋白的质谱鉴定及生物信息学分析选取上述差异蛋白点中的15个，经胶内酶切、MALDI-TOF-MS测定肽质量指纹谱、Mascot数据库查询进行蛋白鉴定，结果表明这15个蛋白点对应15个蛋白，且均为已知功能蛋白，其中有3个蛋白在SAMP8中表达显著上调，12个蛋白表达显著下调。利用公共数据库对上述15个差异蛋白的功能及相关信息进行检索，结果表明，这些蛋白功能可分为以下8类：（1）能量代谢相关蛋白3个，分别是腺苷酸激酶4、α异柠檬酸脱氢酶、ATP合酶（即H⁺传递体，线粒体Fo复合体亚基d）；（2）蛋白合成降解相关蛋白3个，分别是蛋白酶体β4、泛素结合酶E和肽酰脯胺酰胺顺反式异构酶；（3）信号转导相关蛋白1个，为突触后密度蛋白95；（4）转录调控相关蛋白1个，即不均一核内核糖核蛋白H2；（5）核苷酸代谢相关蛋白2个，分别为核苷二磷酸激酶2和5′3′核苷酸酶；（6）细胞骨架蛋白2个，分别是Stathmin 1蛋白和β微管蛋白；（7）细胞周期相关蛋白2个，分别是髓细胞性白血病因子2和CDCREL-1（CDCrel-1，cell-division-control-related protein 1，细胞分裂调控相关蛋白）；（8）其它蛋白1个，为Villin2（绒毛蛋白2）。其中不均一核内核糖核蛋白K、腺苷酸激酶4和β-微管蛋白3个蛋白在SAMP8中表达上调；其它蛋白，包括α异柠檬酸脱氢酶、ATP合酶、突触后密度蛋白95、Stathmin蛋白、蛋白酶体β₄、肽酰脯胺酰胺顺反式异构酶、泛素结合酶E、CDCrel-1和Villin2等在SAMP8海马中表达下调。（二）黄连解毒汤对SAMP8海马蛋白表达的影响1黄连解毒汤对SAMP8海马蛋白表达谱的影响及差异分析采用双向凝胶电泳结合图像分析技术观察了连续灌胃给予2.5g／kgHLJDT 2个月后SAMP8海马蛋白表达谱的变化。结果表明，与SAMP8对照组比较，给予HLJDT后SAMP8海马中出现明显差异表达的蛋白点共有38个，其中18个蛋白点表达显著上调，20个蛋白点表达显著下调。2黄连解毒汤反应蛋白点的质谱鉴定及生物信息学分析选取14个给予HLJDT后表达水平具有明显变化的蛋白点经胶内酶切、MALDI-TOF-MS测定肽质量指纹谱、Mascot数据库查询进行蛋白鉴定，结果有13个蛋白点鉴定获得了肽质量指纹谱，数据库查询表明它们对应13个蛋白，其中11个蛋白为已知功能蛋白，2个为未知功能蛋白。11个已知功能蛋白中，有5个蛋白在给予HLJDT的SAMP8海马中表达显著上调，7个表达显著下调；2个未知功能蛋白给予HLJDT后表达均下调。利用公共数据库对已知蛋白的功能及相关信息进行了检索，结果表明，上述13个具有明确功能的蛋白可分为以下5类：（1）能量代谢相关蛋白6个，分别是α异柠檬酸脱氢酶、ATP合酶（H⁺传递体，线粒体Fo复合体，亚基d）、腺苷酸激酶4、醛缩酶C、α烯醇酶和磷酸甘油酸变位酶；（2）转录调控相关蛋白1个，为不均一核内核糖核蛋白H2；（3）细胞骨架蛋白1个，为Stathmin 1蛋白；（4）氨基酸代谢相关蛋白1个，为谷氨酰胺合成酶；（5）细胞周期相关蛋白2个，分别是septin 11和髓细胞性白血病因子2。其中α异柠檬酸脱氢酶、ATP合酶、腺苷酸激酶4、Stathmin 1蛋白及髓细胞性白血病因子2共5个蛋白，它们在灌胃给予HLJDT后的SAMP8海马中表达上调；醛缩酶C、α烯醇酶、不均一核内核糖核蛋白H2、septin 11、谷氨酰胺合成酶和磷酸甘油酸变位酶1共6个蛋白在给予HLJDT的SAMP8海马中表达下调。此外，另有两个未获功能的蛋白，分别是未命名蛋白1和未命名蛋白2，它们在给予HLJDT后在SAMP8海马中表达均下调。三、黄连解毒汤与六味地黄汤、八味地黄汤和当归芍药散对SAMP8海马蛋白表达影响的比较本室前期已对六味地黄汤（LW）、八味地黄汤（BW）和当归芍药散（DSS）对SAMP8海马蛋白表达的影响进行了研究，获得了给予这些方剂后在SAMP8海马中表达有变化的蛋白，我们暂称之为方剂“反应蛋白”。在本研究中，我们将它们与HLJDT的反应蛋白进行了生物信息学分析与比较，旨在从这四个方剂中寻找它们的共同反应蛋白和各自特异的反应蛋白，以期为抗AD药物筛选和评价“组合靶标”的提出和后续的靶标验证工作提供线索。（一）四方剂的共同反应蛋白对12月龄SAMP8分别给予LW、BW、DSS及HLJDT后获得的差异蛋白及药物反应蛋白进行质谱鉴定和生物信息学分析，并进行比较，得到四方剂的共同反应蛋白共计14个，按功能可分为以下7类，（1）能量代谢相关蛋白6个，分别是磷酸甘油酸变位酶1、烯醇酶1、醛缩酶C、α异柠檬酸脱氢酶、线粒体顺乌头酸酶2和焦磷酸酶；（2）线粒体代谢相关蛋白2个，分别是α丙酮酸脱氢酶和还原型辅酶I-辅酶Q氧化还原酶；（3）信号转导相关蛋白2个，分别是电压依赖性阴离子通道2和酪氨酸蛋白激酶2；（4）神经元凋亡相关蛋白1个，3-巯基丙酮酸硫基转移酶；（5）转录调控相关蛋白1个，不均一核内核糖核蛋白H2。（6）细胞周期相关蛋白1个，septin 11蛋白。（7）蛋白合成分解相关蛋白1个，磷脂酰肌醇转移蛋白。（二）四方剂特异性的反应蛋白上述四个方剂除了共同的反应蛋白之外，还有其特异性的反应蛋白。其中HLJDT特异性的反应蛋白点按其功能可以分为以下5类：（1）氨基酸代谢相关蛋白，为谷氨酰胺合成酶；（2）能量代谢相关蛋白，为ATP合酶；（3）细胞骨架相关蛋白，为Stathmin蛋白；（4）细胞周期相关蛋白1个，髓细胞性白血病因子2；（5）其它蛋白，包括未命名蛋白1和未命名蛋白2。BW特异性的反应蛋白为β伴侣素，属于热休克蛋白类。DSS特异性药物反应蛋白按功能可以分为以下4类：（1）线粒体功能相关蛋白，包括醛脱氢酶、乙醛还原酶、丙酮酸脱氢酶和谷胱甘肽S转移酶；（2）能量代谢相关蛋白，包括腺苷酸激酶和磷酸丙糖异构酶；（3）信号转导相关蛋白，包括肌动蛋白结合蛋白；（4）蛋白降解相关蛋白，泛素羧端水解酶L1；（5）细胞骨架蛋白，fascin蛋白。从LW、BW、DSS和HLJDT对SAMP8海马蛋白表达影响的比较可以看出，这四个方剂既有共同的方剂反应蛋白（14个），也有各方剂特异的反应蛋白。各方剂特异性的反应蛋白可能与它们有不同的作用靶点、作用性质和作用机理有关。而各方剂的共同反应蛋白一方面提示它们可能是与AD发生或学习记忆衰退有关的潜在病理相关蛋白，另一方面提示它们也可能是四方剂防治AD过程中存在的共同或关键作用环节或靶点，有望成为抗AD药物筛选和评价“组合靶标”的组成部分。四、蛋白免疫印迹对部分差异蛋白的验证为了验证采用双向电泳技术结合质谱鉴定所获得的差异蛋白的准确性，本研究选择蛋白免疫印迹实验对差异蛋白的表达进行了验证。根据差异蛋白的功能提示，选择了醛缩酶3，C异构体和还原型辅酶I-辅酶Q氧化还原酶，谷胱苷肽-S-转移酶，谷氨酰胺合成酶，酪氨酸蛋白激酶2共5个蛋白进行验证。双向电泳结合质谱鉴定结果表明，与同龄SAMR1相比，醛缩酶3和C异构体蛋自在SAMP8海马中表达显著上调，给予DSS或HLJDT后它们的表达水平明显下调，给予BW后它们的表达水平有下调趋势；酪氨酸蛋白激酶2在SAMP8海马中表达也显著上调，而给予LW或BW后其表达水平明显下调。双向电泳结合质谱鉴定结果还显示，谷胱甘肽-S-转移酶蛋白在SAMP8海马中表达下调，给予DSS和BW后其表达水平明显上调。此外，还原型辅酶I-辅酶Q氧化还原酶蛋白在SAMP8海马中表达有下调趋势，给予LW和HLJDT后其表达水平上调，但给予BW、DSS后其表达水平进一步下调。谷氨酰胺合成酶在SAMP8海马中表达有上调趋势，给予HLJDT后其表达水平显著下调。蛋白免疫印迹实验结果表明，这5个蛋白的表达情况与双向电泳实验的结果基本一致，提示采用双向电泳结合质谱分离鉴定差异蛋白获得的结果基本可靠。五、腺苷酸激酶4（AK4）在SAM海马中表达的动态变化情况SAM海马蛋白的双向电泳结合质谱鉴定的结果表明，腺苷酸激酶4（adenylatekinase 4，AK4）在2、6及12月龄SAMR1海马中均未见表达，而在各个月龄SAMP8海马中呈高表达，提示AK4可能与老化的发生密切相关。因此，本研究应用免疫印迹实验，进一步观察了AK4在2、6、12及18月龄SAMP8海马中的动态变化情况，并与同龄SAMR1进行了比较。结果显示，AK4在2-18月龄SAMP8中呈高表达，且随增龄其表达水平有逐步升高的趋势，与此相反，其在SAMR1海马中的表达仅出现于18月龄时，且表达非常微弱，其余月龄SAMR1均未见表达。初步提示AK4可能是一个与老化相关的蛋白，值得进一步深入研究。通过以上研究，本论文得到以下结论：1．与同龄SAMR1相比，SAMP8空间学习记忆功能明显下降，被动回避反应能力降低，灌胃给予HLJDT可明显提高SAMP8的空间学习记忆能力，对其被动回避反应能力也有一定改善作用，说明HLJDT具有益智作用。2．12月龄SAMP8和SAMR1海马中有29个差异蛋白点，经质谱鉴定，共鉴定出15个蛋白，均为已知功能蛋白，它们的功能涉及能量代谢、蛋白合成降解、细胞骨架组成、信号转导等。上述差异蛋白可能与SAMP8学习记忆功能障碍有关，可为SAMP8脑老化机制或防治AD药物靶标的研究提供线索。3．灌胃给予HLJDT 2个月后SAMP8海马蛋白表达变化的蛋白点有38个，选择其中14个点进行质谱鉴定，鉴定出13个，其中5个蛋白在给予HLJDT后表达显著上调，8个蛋白给予HLJDT后表达显著下调。结果说明HLJDT对SAMP8海马蛋白的表达具有调节作用，对这些蛋白的功能进行分析和研究有望为揭示HLJDT作用机理乃至发现抗AD药物作用新靶标提供线索。4．比较六味地黄汤、八味地黄汤、当归芍药散及黄连解毒汤这四个临床和实验药理学均证明可有效防治AD的方剂对SAMP8海马蛋白表达的影响，结果表明，这四个方剂既有共同的反应蛋白，也有各自特异的反应蛋白。共同反应蛋白可能是四方剂防治AD过程中存在的共同或关键作用环节或靶点，有望成为抗AD药物筛选和评价“组合靶标”的重要组成部分。5．运用蛋白免疫印迹实验对醛缩酶C、还原型辅酶I-辅酶Q氧化还原酶等五个差异蛋白的表达进行了验证，结果表明，与双向电泳结合质谱的结果基本一致，提示采用双向电泳结合质谱分离鉴定差异蛋白的结果基本可靠。6．应用免疫印迹实验，观察差异蛋白腺苷酸激酶4（AK4）在SAM海马中表达的动态变化情况，结果显示AK4在2-18月龄快速老化小鼠SAMP8中呈高表达，且随增龄其表达水平有逐步升高的趋势，而在正常对照小鼠SAMR1海马中的表达仅出现于18月龄时，且表达非常微弱，其余月龄SAMR1均未见表达。提示AK4可能是一个老化相关的蛋白，值得进一步深入研究。