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前言：
肺炎支原体(MycoplasmaPneumoniae,Mp)是人类原发性非典型肺炎的病原体,其引起感染的治疗与其它细菌和病毒感染的治疗有所不同,因此,Mp感染诊断意义重大。肺炎支原体细胞表面的粘附蛋白及黏附相关蛋白(如P1,P30和P116等)能与宿主细胞受体结合,为Mp致病的重要因素,也是引起机体免疫反应的主要免疫原,应用基因工程技术制备Mp重组蛋白抗原用于检测临床标本,有较高的特异性和敏感性。MpP1-P30和P1-P116嵌合蛋白表达载体的构建已有报道。为了提高诊断的敏感性,本研究拟经PCR技术在Mp全基因组中获取P30、P116和P1蛋白目的基因,与pGEX-6P-1蛋白克隆载体重组,构建含肺炎支原体P1,P30和P116三种优势蛋白抗原表位基因的表达载体,期望通过增加Mp特异的抗原表位点提高重组蛋白的敏感性。为研制更有效的肺炎支原体基因工程诊断试剂奠定基础。
方法：
1、目的基因的筛选
应用NCBI在线分析TMHMM软件筛选MpP116、P30和P1蛋白的跨膜基因,抗原决定簇分析工具方法进行抗原表位预测,蛋白同源性BLAST软件对筛选基因与人的基因库和其它生物文库进行Blast对比分析,从而选择抗原表位多,特异性强,与其他病原微生物无同源性的区域作为预选目的基因。
MpDNA的制备:按本实验室常规方法进行。
2、PCR扩增MpP30、P116和P1目的基因
根据GenBank提供的MpP30、P116和P1蛋白基因序列,通过引物分析软件Primer5.0设计引物,P30上游引物序列:5-FAAAGGATCCGGCAGAAATGCGTTGTAG-3(BamI),P30下游引物序列:5-AAAACTGCAGAACAATACCGAACTGACAGAA-3(PstI),P116上游引物序列:5-AAAACTGCAGAATACCTCAACACCCACG-3(PstI),P116下游引物序列:5-AAAGAATTCCAGCCTCACCAAATAAATC-3(EcoRI),P1上游引物序列:5-GTGAATTCGCGAGTGCTTACAAGC-3(EcoRI),P1下游引物序列:5-AGCTCGAGAAACGGACTAAACAAG-3(XholI)。分别PCR扩增目标片段,反应总体积50μl,95℃5minx1;95℃30s,55℃30s,72℃40s×30;72℃10min×1。回收突变片段,1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
3、Mp克隆载体PMD-T-P30、PMD-T-P116和PMD-T-P1的构建与鉴定
将回收的目的基因和PMD-T载体连接,转入E.coliTG-1。通过氨苄青霉素平板筛选阳性克隆株。质粒提取试剂盒抽提阳性克隆株的重组质粒,PCR扩增及酶切后电泳鉴定。
4、Mp多抗原表位表达载体的构建与鉴定
从克隆株中提取纯化重组质粒,分别用BamHI和PstI(P30片段)、PstI和EcoRI(P116片段)、EcoRI和XholI(P1片段)双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳,回收目的片段,与BamHI、XholI双酶切的pGEX-6P-1表达载体连接,转入E.coliTG-1/JM109。氨苄青霉素平板筛选转化子,提取纯化重组质粒,质粒酶切图谱和PCR扩增鉴定。
5、重组蛋白基因表达的检测与鉴定
将阳性克隆株培养菌液接种于含氨苄青霉素(100ug/ml)的LB液体培养基中,37℃培养过夜。离心收集菌体沉淀,转接至200mL含100AMpLB中,37℃振荡培养1h,加入IPTG至终浓度1.0mmol/L,30℃诱导表达2h。离心收集菌体沉淀。冰裕超声破碎,离心取上清粗提全菌蛋白。SDS-PAGE分析表达产物的相对分子量,免疫印迹实验鉴定其免疫反应性。一抗为兔抗Mp全菌抗体,二抗为羊抗兔IgG-HRP。
结果：
1、P30、P116和P1目的基因片段的扩增与鉴定:PCR扩增后P30片段为273bp,P116扩增的目的基因片段为684bp,P1扩增的目的基因片段为894bp,经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定,扩增产物与理论值大小相符。
2、PMD-T-P30、PMD-T-P116和PMD-T-P1重组质粒鉴定:以构建好的两种PMI)-T载体为模板,PCR扩增出单一条带,长度与预期一致,PMD-T-P30用BamHI、PstI双酶切,PMD-T-P30用PstI、EcoRI双酶切,PMD-T-P1用EcoRI、XholI双酶切分别产生2.7kb、273bp和2.7kb、684bp及2.7kb、894bp两个片段。。
3、Mp表达载体的构建与鉴定:以重组质粒为模板,分别用P30、P116和()引物PCR扩增,都可以得到单一条带,且长度与预期一致。重组质粒分别用BamHI、PstI双酶切产生273bp、2.6kb、4.0kb三个片段(pGEX-6-P-I载体本身(含在)一个PstI酶切位点PstI、EcoRI双酶切可从载体中获得一958bp片段),用PstI、EcoRI双酶切产生684bp、1.9kb、4.3kb三个片段,用BamHI、EcoRI双酶切产生894bp和5.8kb两个片段,用BamHI、XhoI双酶切产生1.9kb和4.9kb两个片段。基因测序结果插入基因片段与已知的P30、P116和P1核苷酸序列进行比较完全一致。
4、重组蛋白抗原性检测:经诱导后Westernblotting结果显示,构建好的重组质粒菌株获得一条约80kDa的特异性抗原一抗体反应条带,小于预期的91kDa,原因有待进一步探讨。
结论：
本实验经生物信息分析技术筛选出含有特异抗原表位区的MpP30、P116和P1蛋白目的基因片段,并构建了含MpP30、P116、P1三种蛋白抗原表位的表达载体()pGFX-6-P-1-P30-P116-P1),该研究为研制敏感特异的Mp抗原诊断试剂奠定基础。