目的：Alzheimer’s病(Alzheimer’s disease, AD)是一种以进行性认知障碍为主的中枢神经系统退行性疾病,其病理特征为老年斑(Senile plaque, SP)形成、神经原纤维缠结(Neurofibrillary tangle, NFT)和大量神经元丢失。p淀粉样蛋白(amyloid-p, Aβ)被认为是AD患者脑内SP中最主要的成分,是AD形成和发展的关键因素。C反应蛋白(C-reactive protein, CRP)是炎症急性期的一个关键正五聚蛋白。研究显示CRP水平的升高与AD患者认知功能障碍有显著关联。我们前期通过脑室给予大鼠CRP,发现CRP能导致大鼠出现AD样的认知功能障碍,提示CRP可能是AD的重要致病因子。本课题的目的在于以PC12细胞作为研究对象,利用CRP及其拮抗剂1,6-二(磷酸胆碱)己烷(1,6-bis(phosphocholine)-hexane, bis(PC)-H)初步探讨CRP与Aβ的调节关系,尤其是明确CRP细胞毒性与Aβ生成相关因子淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)> β-分泌酶(β-site of APP cleaving enzyme, BACE-1)、早老素1(presenilins-1, PS-1)和早老素2(presenilins-2, PS-2)的表达凋控关系,为明确CRP是否可以作为调控AD发病的新靶点提供理论依据；并应用CRP拮抗剂bis(PC)-H和Aβ作为研究工具,通过观察bis(PC)-H能否拮抗Ap的细胞毒性,初步验证CRP是否处于调控Aβ的上游；继而以APP/PS1转基因小鼠作为研究对象模拟AD发病早期,通过测定CRP和Aβ1-42的脑内水平进行相关性分析,并检测CRP相关因子血清淀粉样P物质(serum amyloid P component, SAP)、补体C1q、C3和肿瘤坏死因子-a (tumor necrosis factor-a, TNF-a)的编码基因表达水平,从而探明CRP在AD发病早期的变化情况及其相关机制；并利用4个月龄的APP/PS1转基因小鼠,脑室给予CRP及其拮抗剂后,通过行为学测试,观察CRP是否能影响APP/PS1转基因小鼠记忆力,通过分析脑内Aβ斑块的形成以明确CRP参与AD早期发病过程的机制。方法：(1)以PC12细胞作为研究工具,先确定bis(PC)-H的无毒性浓度范围。空白对照组和CRP组加入DMEM, bis(PC)-H组加入含bis(PC)-H的DMEM,孵育3h后吸弃上清,空白对照组加入DMEM, CRP组和bis(PC)-H组均加入含1μM CRP的DMEM,继续孵育48h,最后MTT法测定细胞相对活力,并测定细胞上清液LDH外漏的水平。另外,空白对照组和CRP组加入DMEM, bis(PC)-H低、中、高组加入含bis(PC)-H(终浓度分别为20、40、80gM)的DMEM,bis(PC)-H对照组加入含bis(PC)-H(终浓度分别为80μM)的DMEM。孵育3h后吸弃上清液,空白对照组和bis(PC)-H对照组加入DMEM, CRP组和bis(PC)-H低、中、高组均加入含亚毒性浓度CRP (0.2μM)的DMEM继续孵育。48小时后收集细胞上清液,ELISA测定Aβ1-42；并提取细胞RNA和蛋白,通过Real-time PCR和Western blotting检测Aβ生成相关因子的表达。(2)空白对照组加入DMEM,其余各组加入分别含Aβ25-35和Aβ1-42的DMEM。孵育48h后用MTT法测定细胞相对活力,以确定Aβ25-35和Aβ1-42的细胞毒性浓度。另外,空白对照组和Ap组加入DMEM,其余各组加入含bis(PC)-H(终浓度分别为30、150、300、1500、3000μM)的DMEM,孵育3h后吸弃上清液,空白对照组加入DMEM, Aβ组和bis(PC)-H各组均加入含Aβ25-35或Aβ1-42的DMEM,继续孵育48h,最后用MTT法测定细胞相对活力,并测定细胞上清液LDH外漏的水平。(3)分别为1、2、3个月龄的APP/PS1转基因小鼠和野生型小鼠饲养一周以适应环境。转基因小鼠PCR鉴定基因型后筛选使用。小鼠在水合氯醛深度麻醉的情况下处死,取其大脑半球用4℃PBS液洗两次后用组织匀浆液提取蛋白,完成蛋白浓度测定后用ELISA试剂盒测定稀释样品的CRP和Aβ1-42的水平,并进行两者的相关性分析。另外,在冰上切割和称取40mg脑组织样品于消毒过的匀浆玻璃内,用risol提取RNA,先直接测定RNA浓度,其余RNA按照其浓度进行反转录得到cDNA,通过Real-time PCR检测CRP及其相关因子SAP、Clq、C3和TNF-a mRNA的表达水平。(4)3个月龄的APP/PS1转基因小鼠和野生型小鼠饲养一个月以待使用。转基因小鼠PCR鉴定基因型后筛选使用。将4个月龄的实验小鼠分成5组,每组6只,分别为WT溶剂组(WT, aCSF)、APP/PS1溶剂组(APP/PS1, aCSF)、APP/PS1bis(PC)-H0.2组(APP/PS1,0.2nmol/只)、APP/PS1bis(PC)-H1.0组(APP/PS1,1.0nmol/只)和APP/PS1CRP组(APP/PS1,0.02nmol/只)。实验小鼠麻醉后固定于脑立体定位仪,暴露前囱,进行右侧脑室定位,用玻璃离子体水门汀把定位准确的套管固定后套上内芯。术后第8天经微量注射泵侧脑室注射(i.c.v.)相应的溶液。隔天注射一次(q.o.d.)。给药后第60天依次进行物体识别测试、水迷宫测试和跳台测试。行为学测试结束后24h内麻醉处死小鼠,取出大脑做石蜡切片的Aβ免疫组化染色。结果：(1)通过MTT法测定,发现30～3000μM bis(PC)-H未对PC12细胞相对活力产生显著性影响,说明bis(PC)-H自身在接下来的细胞毒性实验中不发挥毒性效应。单独给予1μ,M的CRP孵育48h后,PC12细胞的相对活力显著下降,表明CRP对PC12细胞产生毒性作用；当以12.5～400μM bis(PC)-H预孵3h后再给予1μM的CRP孵育48h后,PC12细胞相对活力并没有出现明显下降,显示bis(PC)-H浓度依赖性地拮抗CRP对PC12细胞产生的毒性作用,当bis(PC)-H的浓度为25、50、100、200、400μM时有统计学差异。单独给予1μM的CRP孵育48h后,PC12细胞的LDH外漏明显增加,表明CRP对PC12细胞产生损伤作用；当以12.5～400μM bis(PC)-H预孵3h后再给予1μM的CRP孵育48h后,PC12细胞LDH外漏不明显,显示bis(PC)-H浓度依赖性地拮抗CRP对PC12细胞产生的损伤作用,当bis(PC)-H的浓度为25、50、100、200、400μM时与CRP组相比具有统计学差异。接着在CRP亚毒性浓度的基础上进行机制探讨。Real-time PCR结果显示,单独给予CRP (0.2μM)孵育48h后,PC12细胞的APP、BACE-1、PS-1、PS-2和内源性CRP mRNA表达均显著上升。当40μM bis(PC)-H预孵3h后能逆转CRP诱导的BACE-1. PS-2和内源性CRP mRNA表达的上调,当80μM bis(PC)-H预孵3h后能逆转CRP诱导的APP. BACE-1. PS-1. PS-2和内源性CRP mRNA表达的上调。Western blotting结果显示,单独给予CRP (0.2μM)孵育48h后,PC12细胞的APP. BACE-1和PS-1的蛋白表达均显著上升。当40μM bis(PC)-H预孵3h后能逆转CRP诱导的BACE-1和PS-1蛋白表达的上调；当以80μM bis(PC)-H预孵PC12细胞3h后能显著逆转CRP诱导的APP、BACE-1和PS-1蛋白表达的上调。结果表明,CRP可诱导PC12细胞的Aβ生成相关因子及其编码基因表达的上调,bis(PC)-H逆转CRP诱导的这些上调。ELISA结果显示,单独给予CRP (0.2μM)孵育48h后,PC12细胞上清液的Aβ1-42水平显著上升,当以40.80μM bis(PC)-H预孵有显著性差异,表明CRP可诱导PC12细胞产生Ap1-42, bis(PC)-H通过拮抗CRP活性逆转CRP诱导的A61-42表达上调。(2)当以10.20、30μM A(325-35处理细胞后其相对活力显著下降。选定30μM作为Aβ25-35的细胞毒性浓度进行毒性拮抗实验,发现以30～3000μM bis(PC)-H预孵3h后再给予30μM Aβ25-35孵育48h,PC12细胞相对活力下降的程度没有得到改善,表明bis(PC)-H不能拮抗Aβ25-35的毒性作用。同时,以30～3000μM bis(PC)-H预孵3h后再给予Aβ25-35, PC12细胞LDH外漏同样出现明显的增加,表明bis(PC)-H不能拮抗Aβ25-35对PC12细胞产生的损伤作用。接着又用Aβ1-42代替Aβ25-35进行验证。当以1.0.2.5、5.0、10μM Ap1-42处理细胞后其相对活力显著下降。我们选定5.0μM作为Aβ1-42的细胞毒性浓度,发现以30～3000μM bis(PC)-H预孵3h后再给予5.0μMAβ1-42孵育48h,PC12细胞相对活力下降的程度没有改变,表明bis(PC)-H不能拮抗Aβ1-42的细胞毒性。同时,以30～3000μM bis(PC)-H预孵3h后再给予5.0μM Aβ1-42孵育48h,PC12细胞LDH外漏同样出现明显的增加,表明bis(PC)-H不能拮抗Aβ1-42对PC12细胞产生的损伤作用。(3)我们分别采集1、2、3个月龄的APP/PS1转基因小鼠及其同龄WT小鼠的脑组织进行ELISA测定,发现APP/PS1转基因小鼠脑组织Aβ1-42的水平随着月龄的递增而递增,2个月龄和3个月龄的转基因小鼠与同龄WT小鼠相比有显著的升高。同样,转基因小鼠脑组织CRP的水平也随着月龄的递增而递增,3个月龄的转基因小鼠与同龄WT小鼠相比有显著的升高。对APP/PS1转基因小鼠脑内CRP和Aβ1-42的水平进行相关与回归分析,发现其CRP与Aβ1-42水平存在显著的正相关(r=0.818),线性回归方程有统计学差异,表明CRP水平在AD疾病早期已经异常,推测CRP通过对Aβ1-42的调节参与AD早期的疾病过程。接着对CRP及其相关因子的mRNA进行测定,发现转基因小鼠脑组织CRP、SAP、Clq和TNF-a mRNA的表达水平随着月龄的递增而递增。2个月龄的APP/PS1转基因小鼠CRP和C1q mRNA的水平与同龄WT小鼠相比有显著的升高。3个月龄的APP/PS1转基因小鼠CRP、SAP、Clq和TNF-amRNA的水平与同龄WT小鼠相比均有显著升高。但C3mRNA的水平没有显著变化。因此推测CRP与Aβ1-42参与AD早期的发病过程可能需要SAP、Clq、TNF-a等因子的参与。(4)物体识别实验结果显示,不同的基因型和处理不影响实验小鼠对相同物体的识别行为。在新物体识别阶段,APP/PS1溶剂组的识别指数有下降趋势,推测APP/PS1转基因小鼠的记忆能力出现一定程度的损伤。与APP/PS1溶剂组相比,APP/PS1bis(PC)-H0.2和1.0组的识别指数均有升高的趋势,说明拮抗CRP有逆转APP/PS1转基因鼠出现轻度记忆力下降的趋势。与WT溶剂组相比,APP/PS1CRP组的识别指数显著下降,表明CRP可以诱发APP/PS1转基因小鼠的记忆力损伤。Morris水迷宫实验结果显示,在习得性实验中,WT溶剂组小鼠寻找平台的时间逐渐缩短,说明每天训练可强化其学习记忆。APP/PS1溶剂组小鼠需要更长时间才能找到隐性平台,说明APP/PS1转基因小鼠的空间记忆力出现一定程度的损伤。与APP/PS1溶剂组相比,APP/PS1bis(PC)-H0.2和1.0组小鼠找到隐性平台的潜伏期有缩短的趋势。与WT溶剂组相比,APP/PS1CRP组小鼠找到隐性平台的潜伏期显著延长,说明CRP可以加重APP/PS1转基因小鼠的学习记忆力损伤。各组的平均游泳速度没有差别,说明不同基因型和处理不影响动物的运动能力。在探索性实验中,APP/PS1溶剂组小鼠在平台所在象限探索的时间有下降势,表明其空间记忆出现一定损伤；拮抗CRP则可逆转其在平台所在象限探索时间下降趋势。与APP/PS1溶剂组相比,APP/PS1CRP组小鼠的探索时间显著性下降,表明CRP可以加重APP/PS1转基因小鼠出现空间记忆力损伤。同时,与WT溶剂组相比,APP/PS1溶剂组小鼠穿越平台次数有下降的趋势；而拮抗CRP则可以逆转APP/PS1转基因小鼠的空间记忆能力轻度损伤的趋势。与APP/PS1溶剂组相比,APP/PS1CRP组小鼠穿越平台次数显著下降,表明CRP可以诱发APP/PS1转基因小鼠出现明显的空间记忆损伤。各组平均游泳速度无差异,说明各组在探索性实验中的行为学差异不是因为运动能力不同导致的。跳台实验显示,WT溶剂组小鼠只需接受4次训练就记住电刺激,而APP/PS1溶剂组小鼠则需接受5次训练,说明APP/PS1转基因小鼠对被动性刺激的记忆力有所损伤。与APP/PS1溶剂组相比,APP/PS1bis(PC)-H1.0组的学习次数有下降趋势,说明拮抗CRP有逆转其出现轻度记忆力下降的趋势。与WT溶剂组相比,APP/PS1CRP组对电刺激记忆的学习次数高达6次以上,有统计学差异,说明CRP可以诱发其对被动性刺激的记忆力损伤。24h之后,APP/PS1溶剂组小鼠对电刺激记忆的保留时间较WT溶剂组出现下降,说明其记忆保留能力有所损伤。与APP/PS1溶剂组相比,APP/PS1bis(PC)-H1.0组的停留时间有升高的趋势,说明拮抗CRP有逆转小鼠出现轻度记忆损伤趋势。与WT溶剂组相比,APP/PS1CRP组对电刺激记忆的保留时间显著缩短,说明CRP可以诱发APP/PS1转基因小鼠对被动性刺激的记忆力损伤。免疫组化结果显示,接受aCSF脑室注射的野生型小鼠大脑皮层几乎没有Aβ免疫染色,表明手术和给药未改变小鼠皮层Aβ斑块形成；APP/PS1溶剂组小鼠出现典型的Ap斑块,斑块负载量显著升高；APP/PS1bis(PC)-H0.2和1.0组的Aβ斑块负载量出现下降,其中bis(PC)-H1.0组有统计学差异,说明拮抗CRP有抑制APP/PS1转基因鼠脑内Aβ斑块形成的作用；而APP/PS1CRP组的Aβ斑块负载量比APP/PS1溶剂组显著升高,说明CRP可以诱发APP/PS1转基因小鼠大脑皮层Aβ斑块的形成,提示不同基因型和给药处理导致小鼠学习记忆的差异与大脑皮层Ap斑块的形成相关。结论：CRP对PC12细胞产生毒性损伤作用；bis(PC)-H则通过拮抗CRP活性浓度依赖性地逆转CRP对PC12细胞产生的毒性损伤作用。亚毒性浓度的CRP处理PC12细胞后可以诱导其Aβ生成相关因子和内源性CRP的mRNA表达显著上升,同时诱导Ap生成相关因子和Aβ1-42的蛋白表达显著上调；bis(PC)-H可逆转CRP诱导的Aβ生成相关因子及其编码基因、内源性CRP mRNA以及Aβ1-42表达的上调,从而为确定CRP作为调控AD发病的新靶点提供新的实验基础和理论依据,为防治AD提供新的思路。Aβ25-35和Aβ1-42均可对PC12细胞产生毒性损伤作用,但bis(PC)-H不能拮抗Aβ25-35和Aβ1-42的细胞毒性损伤作用。我们的离体实验证明了CRP可以调节Ap的生成,可能作为Aβ的上游因子参与AD的发病。而动物实验的结果显示,APP/PS1转基因小鼠脑内CRP与Aβ1-42的水平均随月龄的递增而递增,二者存在正相关。结合离体实验,我们推测CRP可能通过调节Aβ1-42的生成参与AD早期的发病。同时发现SAP, Clq, TNF-a等的水平变化与CRP相似,但C3没有变化,推断炎性因子而非补体系统是CRP参与AD早期发病的重要因素。我们通过脑室给药的方式给予疾病早期的APP/PS1转基因小鼠CRP及其抑制剂,发现CRP及其抑制剂可以影响其学习记忆能力和Ap斑块的形成。拮抗CRP可以逆转APP/PS1转基因小鼠轻度学习记忆损伤的趋势并减少其Ap斑块的形成,而给予CRP则可以加重APP/PS1转基因小鼠的学习记忆损伤并增加其Aβ斑块的形成,一正一反地证明了CRP参与AD转基因小鼠的发病,为阐明AD的发病机制提供了新的理论基础。