背景:在牙周炎的发生和发展过程中,牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)起着重要作用,它是慢性牙周炎的机会致病菌,也是龈下生物膜的重要组成部分。生物膜的主要成分有各种微生物细胞,胞外多糖,水及细胞的代谢产物,而口腔细菌就常以生物膜的方式存在于口腔中,并进一步发展成为菌斑,危害口腔健康。生物膜是一个动态的环境,在其形成的过程中细菌呈现的状态以及基因的表达都会是不同的。胞外多糖构成了生物膜的骨架,如果抑制或者破坏多糖的表达将会大大影响生物膜的稳定性和完整性[1]。近年来,一些研究已经表明黄连素可能抑制牙龈卟啉单胞菌的生长,然而暂无任何研究阐述黄连素在P.g细菌荚膜及口腔生物膜的合成、抑制该细菌分裂增殖、等方面的分子生物学机制。P.g参与的龈下菌斑诱导牙龈的出血及感染,近来口腔种植体的逐步流行,术后出现种植体周围炎的病例也有所增多,临床用药十分有限。随着国际上对黄连素作为新型抗菌素研究的深入,本文希望通过研究黄连素作用于P.g的分子生物学机制,探讨黄连素作为一种新型的口腔牙周细菌生物膜抑制剂的可行性,从而达到预防和治疗牙周病的效果。依据这一事实我们的长期目标将试图阐述黄连素抑制牙龈龈卟单胞菌表达的分子生物学机制:1、黄连素抑制牙龈卟啉单胞菌生长与细菌分裂蛋白ftsZ的组装功能有关。2、黄连素抑制牙龈卟啉单胞菌的荚膜多糖及细菌生物膜的表达和合成。目的:(1)探究黄连素抑制牙龈卟啉单胞菌生长的分子生物学机制。(2)黄连素对牙龈卟啉单胞菌参与的生物膜产生抑制作用,并揭示在药物作用下牙龈卟啉单胞菌的荚膜多糖的变化。方法:通过测试牙龈卟啉单胞菌W83和ATCC33277在不同浓度的黄连素作用下的生长曲线来确定黄连素是否对牙龈卟啉单胞菌的生长有影响;通过斑点血平板实验检测高浓度的黄连素是否能够杀灭牙龈卟啉单胞菌;在黄连素抑制牙龈卟啉单胞菌的生长曲线的基础上,使用电镜观察及BactlightRed荧光染色检测黄连素是否可以改变细菌的形态,并假设细菌形态的改变是因为黄连素调控牙龈卟啉单胞菌的分裂蛋白ftsz基因的表达量;通过拉曼光谱技术检测在黄连素作用下的牙龈卟啉单胞菌的表面形貌的变化;采用实时荧光定量PCR技术检测在不同浓度的黄连素作用不同的时间下编码牙龈卟啉单胞菌分裂蛋白ftsz基因表达的变化;通过RT-PCR技术检测在不同浓度的黄连素作用下对牙龈卟啉单胞菌的荚膜多糖合成蛋白基因的影响;通过96孔聚氯乙烯板生物膜培养法,使用酶标仪测得OD570值检测黄连素作用下生物膜的表达。结果:将生长14小时的牙龈卟啉单胞菌用新鲜的TSB培养基稀释成OD600=0.2后,分别加入黄连素使黄连素的终浓度为0 mg/ml,0.01 mg/ml,0.05 mg/ml,0.1 mg/ml继续生长30小时后,绘出牙龈卟啉单胞菌的生长曲线。生长曲线结果表明在黄连素浓度为0.01mg/ml,0.05 mg/ml,0.1 mg/ml时均抑制了牙龈卟啉单胞菌W83和ATCC33277的生长;使用0 mg/ml,0.05 mg/ml,0.1 mg/ml,0.5 mg/ml的黄连素浓度进行血平板斑点实验,结果显示在0.5 mg/ml的黄连素滤纸周围几乎没有牙龈卟啉单胞菌的生长;电镜观察及BactlightRed荧光染色镜下发现在0.05 mg/ml黄连素作用4小时相对于对照组(无黄连素)牙龈卟啉单胞菌出现长度增长;拉曼光谱技术结果证明黄连素与牙龈卟啉单胞菌之间确实存在相互作用并且改变细菌的性状;Real-tinmePCR结果显示同一时间点随着黄连素浓度的升高ftsz基因的表达量增多,同一黄连素浓度随着作用时间的延长Ftsz的表达量同样增多。生物膜实验结果表明在同一时间段随着黄连素的浓度增加OD570值降低(OD值代表生物膜的形成量),在同一黄连素浓度作用下,生物膜的表达量随着作用时间的延长而降低。结论:1、黄连素通过改变细菌的形态,影响细菌分裂,从而抑制牙龈卟啉单胞菌的生长。2、黄连素与牙龈卟啉单胞菌的相互作用促进了ftsz基因的表达。3、黄连素通过抑制荚膜多糖的表达,进而抑制牙龈卟啉单胞菌生物膜的形成。