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目的:通过使用不同浓度的KB溶液对人瘢痕成纤维细胞以及小鼠愈合创面进行干预作用,观察KB对于人瘢痕成纤维细胞的抑制作用以及对于小鼠愈合创面的抗炎作用,从而探讨使用KB抑制增生性瘢痕形成的途径,并且初步评估不同浓度KB溶液在作用中的不同表现。 方法:采集18-44岁增生性瘢痕患者,术中切除皮肤瘢痕组织,分离获得人瘢痕成纤维细胞(HSFB)。选取第3-5代HSFB用于实验。 1.采用荧光定量反转录检测人瘢痕成纤维细胞经过不同浓度KB刺激(0、100、150、200、250mg/ml)分成NC、A、B、C、D5组(其中NC组对照组,A、B、C、D组为实验组),依次测定Col-1,Col-3,a-SMA mRNA含量后,数据通过单因素方差分析统计处理。 2.首先选取状态良好的HSFB进行增殖培养。然后将条件成熟的细胞用于细胞增殖实验和细胞凋亡实验,细胞增殖实验分为5组,分别为(0、100、150、200、250mg/ml)KB浓度组。滴入CCK-8试剂1-4h观察细胞生长形态及分布情况,酶标仪在450nm处记录OD值,统计活细胞数量。细胞凋亡实验分为3组,KB浓度分别为0、100、200ug/ml,将接种好的细胞放在CO2细胞培养箱中培养24h,当细胞长到每视野倍镜下60%左右加入KB干预24h,离心后按照试剂盒操作,用流式细胞仪分析数据。 3.建立小鼠腹背部约为1cm×1cm的创面模型,随机将30只Bal/c小鼠分为0ug/ml、100ug/ml、150ug/ml、200ug/ml、250ug/ml剂量组,(n=6)。标记为NC、A、B、C和D组分笼饲养。为了排除对小鼠创面愈合的其他影响,每次给药时均在创缘四周皮下注射0.1ml。0ug/ml组予以无菌NaCl处理;实验组注射不同浓度的KB溶液。各组处理频率为2天1次,间断给药7次,共15天,每日观察创面愈合时间及愈合情况。愈合后切片做HE、Masson染色,进行统计分析。 结果:1.PCR结果:将用药组与对照组进行比较,统计分析后发现,用药组能显著抑制Col-1,Col-3,a-SMA的表达,与0ug/ml组相比用药组均有显著统计意义(P<0.05)。用药组之间进行两两相互比较后显示:KB浓度在>200ug/ml抑制作用明显增强,且有统计学意义(P<0.05)。 2.细胞增殖结果显示:对人瘢痕成纤维细胞进行24小时KB刺激处理后,发现KB能明显抑制HSFB。将对照组与各实验组之间比较发现实验结果均有显著统计学意义。在对实验组A、B、C和D组之间进行比较后得出结果:KB浓度对于HSFB增殖的抑制作用无明显差异。细胞凋亡实验显示:通过各种浓度的KB(0、100、200ug/ml),对HSFB给予24小时刺激处理后,发现KB能明显促进HSFB的凋亡,且均有显著统计学差异。 3.KB影响小鼠创面的愈合作用:与对照组相比,用药组对FB增殖作用以及胶原蛋白的合成显著低于对照组,胶原排列相对整齐,炎性介质浸润相对少于对照组,可见新生血管再生。 结论:1:KB显著抑制了Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和ɑ-SMA mRNA的表达水平,表明KB对于瘢痕组织中ECM的过度表达起到了抑制作用,抑制瘢痕的挛缩与形成。 2:KB抑制了HSFB的增殖活性,对HSFB的凋亡具有一定促进作用。 3:KB在小鼠受损创面修复中对FB的增殖以及炎性浸润具有抑制作用。