背景与目的中国是世界上食管癌高发国家,其中山西、广东(潮汕)、河北、江苏、四川、河南为6个高发区[1]。早期食管癌根治术后预后良好,10年生存率可达95%。然而事实上食管癌病人就诊时多处于中晚期,相当多的病人已失去手术机会,5年生存率低于10%。因此提高食管癌早期诊断率和针对食管癌病因学的预防研究十分重要。目前,食管癌确切病因并未清楚。近年来有关微生态学即细菌在肿瘤发病中的作用已成为研究的热点。早在1982年Finlay就利用微生物培养方法确定正常人食管是无菌环境,或只是“过路”菌,而这些“过路”菌是通过吞咽下来或通过胃食管反流而来。近年来由于分子生物学技术如高通量基因芯片和第二代测序技术的发展应用,使得人们认识到了过去不能培养出的细菌,Zhiheng Pei等人应用16S rDNAPCR技术检测发现正常人远端食管组织最常见的细菌有链球菌属、普氏菌属和韦荣氏球菌属三种菌。2013年Aleksandar Kostic和Mara Roxana Rubinstein研究小组通过肠肿瘤形成小鼠模型和人类结肠癌细胞实验,证实具核梭杆菌诱导促炎症反应和致癌活动,促进结直肠癌生长。2012年James J Farrell研究通过对胰腺癌患者和健康者的唾液微生物菌群比较,发现唾液菌群在胰腺癌患者中存在着显著变化,表明唾液细菌学改变具有胰腺癌预测诊断价值。2009年Yang等人研究发现不同疾病状态下食管微生物菌群不同,正常食管以链球菌为主,食管炎和Barrett(BE)食管则以革兰氏阴性厌氧菌为主,而关于食管癌特别是鳞癌的组织细菌学变化未见报道。研究已表明,与血清一样,唾液同样含有与酶类、激素、抗体、微生物成分及生长因子等分子,而这些分子通过被动扩散、主动转运、胞外超过滤等方法经唾液腺细胞由血液分泌进入唾液中。所以唾液被喻为“人体健康的一面镜子”,能反映机体正常和疾病状态[2]。近年来由于基因芯片和二代测序技术等分子生物学研究技术进展,发现了人口腔内含多达700多种细菌,其中35-50%不能用传统方法培养出来,而这些不能被培养的细菌种类可能与人类健康及及疾病的的发生有关。正常健康成人唾液中绝大多数细菌属于链球菌属、普氏菌属、奈瑟氏菌属、梭形杆菌属、韦荣氏球菌属、Aggregatibacter等。这些口腔微生物群落之间、微生物群落与宿主之间存在着密切且复杂的相互作用,维系着宿主的健康。因此,分析唾液中微生物多样性和特异性,与研究胃肠道细菌一样,对人体相关疾病的发病机制研究和诊断预测、疾病预防和治疗均有重要意义。由于食管细菌多来源于口腔,我们推测口腔细菌与食管癌发病也具有相关性。有关唾液中细菌及食管癌组织内细菌的变化特点和临床意义至今国内外未见研究报道。本研究将选择食管鳞癌患者为研究对象,采集病人唾液和食管局部肿瘤组织,进行微生物菌群的研究,并与正常人相比较,寻找疾病显著相关差异性特征菌属/种。方法研究对象:收集2014年3月-2015年7月在广东省人民医院(广东省医学科学院)伟伦内镜中心诊断的食管癌患者唾液及肿瘤组织,食管癌患者均经内镜活检病理证实为鳞癌,之前4周内未接受抗生素、PPI、益生菌、手术及化疗治疗,同时收集无消化道症状且胃镜检查正常的健康对照组的正常食管下段组织及唾液。以12例年龄、性别、民族匹配,无任何肿瘤病史的健康体检者作为对照。课题已通过广东省人民医院(广东省医学科学院)的伦理委员会审查,所有研究个体均签署知情同意书。标本收集:1.组织收集:胃镜检查前且未服用相关药物,食管癌患者取镜下怀疑是肿瘤的组织,正常对照人群取镜下距距鳞柱交界2cm处的正常食管粘膜;取材后置于无菌EP管内。2.唾液收集:在唾液收集前,研究个体需要禁食、禁水2h以上,唾液收集量需要5ml以上,30分钟内完成。组织及唾液均放置-80℃冰箱保存。将研究对象资料在EXCEL表中整理,包括民族、年龄、性别、是否有不良嗜好(如吸烟喝酒)、病理结果等情况。测序与生物学分析:用QIAamp(?)DNAMini Kit(Germany QIAamp公司)提取组织总 DNA 及用 UltraClean(?)Microbial DNA Isolation Kit 提取唾液总 DNA,要求DNA总量≥150ng;DNA浓度≥5ng/μl;有明显主带,无降解、无RNA和蛋白质等杂质污染。取适量DNA于离心管中,根据V4区使用带Barcode的引物515F和806R,进行PCR,对目的条带使用进行产物回收后构建信息学分析,通过Alpha Diversity分析了解菌群丰度及多样性;通过Beta Diversity比较细菌群落结构的分析,利用LEfSe分析寻找疾病显著相关性菌群或菌种。统计学方法:采用SPSS 19.0软件进行统计分析,P<0.05为差异有统计学意义。年龄间差异及组间菌群相对丰度的差异采用Mann-Whitney检验,OTUs数量及alpha多样性指数差异采用两独立样本t检验。LEfSe分析首先使用non-parametric factorial Kruskal-Wallis sum-rank test 检测不同分组间丰度差异显著的物种然后用成组Wilcoxon秩和检验来进行组间差异性判断,最后用线性判别分析(LDA)来实现降维和评估差异显著物种的影响大小(LDAScore)。结果本研究纳入食管癌患者12例,正常对照组12例。食管癌组平均年龄为64岁,正常对照组平均年龄57岁,组间在年龄、性别及种族方面无差异(P>0.05)。食管癌组根据病理类型证实为食管鳞癌。从稀释曲线、Chao1指数、Shannon指数和Rank abundance曲线等alpha多样性分析,提示测序量足以覆盖食管组织细菌种属,两组样本丰富度和均匀度较好,总体上看,发现食管内有59个菌门174种细菌,在门水平,正常对照组食管内相对丰度处于前10位的细菌门类为:厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、梭杆菌门(Fusobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、蓝藻菌(Cyanobacteria)、螺旋体门(Spirochaetes)、酸杆菌门(Acidobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、软壁菌门(Tenericutes)。相对丰度大于1%的有6种,厚壁菌门(Firmicutes)高达41.95%、变形菌门(Proteobacteria)26.81%、拟杆菌门(Bacteroidetes)占 15.40%、梭杆菌门(Fusobacteria)占 8.32%、放线菌门(Actinobacteria)占 2.59%、蓝藻菌占(Cyanobacteria)1.21%。食管癌患者食管内相对丰度位于前10位为:厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、梭杆菌门(Fusobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、螺旋体门(Spirochaetes)、酸杆菌门(Acidobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、蓝藻菌(Cyanobacteria)、软壁菌门(Tenericutes),相对丰度超过1%的优势菌门共6种,分别是厚壁菌门(Firmicutes)占33.13%、变形菌门(Proteobacteria)占30.47%、拟杆菌门占 Bacteroidetes)17.01%、梭杆菌门(Fusobacteria)占 11.46%、放线菌门(Actinobacteria)占 1.94%、螺旋体门(Spirochaetes)占1.68%。PCoA 分析可基本将食管癌组和正常对照组食管内细菌群落区分开(横坐标PC1贡献度为15.47%,纵坐标PC2贡献度5.5%),说明两组群落构成不同。食管癌组与正常对照组通过LEfse分析得出有差异性菌群有15个,分别是毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)、月形单胞菌属(Selenomonas)、Oribacterium、假单胞菌目(Pseudomonadales)、假单胞细菌科(Pseudomonadaceae)、绿黄假单胞菌(viridiflava)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)、巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae)、巴斯德氏菌目(Pasteurellales)、Gemellaceae、Gemellates、奈瑟氏菌属(Neisseria)、奈瑟菌目(Neisseriales)、奈瑟氏菌科(Neisseriaceae),其中前八个在正常对照组富集,后七个在食管癌组中富集。唾液内发现共有31个菌门98种细菌,在门水平,正常对照组唾液内相对丰度处于前10位的细菌门类为:变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、梭杆菌门(Fusobacteria)、TM7、放线菌门(Actinobacteria)、SR1、螺旋体门(Spirochaete)、无壁菌门(Tenericutes)、互养菌门(Synergistes)。相对丰度超过1%的优势菌门依次是变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、梭杆菌门(Fusobacteria)、TM7、放线菌门(Actinobacteria)。食管癌患者唾液内相对丰度位于前10位为:变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、梭杆菌门(Fusobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、TM7、SR1、螺旋体门(Spirochaete)、无壁菌门(Tenericutes)、互养菌门(Synergistetes);相对丰度超过1%的优势菌门依次是变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、梭杆菌门(Fusobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、TM7、SR1。食管癌组的 Chao1、Ace、Shannon 指数显著高于正常对照组,说明食管癌组唾液中菌群丰度及多样性比正常对照组高,并发现22个菌属丰度增高,3个菌属丰度降低。食管癌患者与正常对照组唾液内相关细菌群落构成的PCoA分析显示,横坐标PC1贡献度为19.21%,纵坐标PC2贡献度6.61%,可基本将食管癌组和正常对照组食管内细菌群落区分开,说明两组群落构成不同。食管癌组与正常对照组通过LEfse分析得出有差异性菌群只有1个,即是厚壁菌门(Firmicutes)下的乳杆菌属(Lactobacillus),在食管癌组富集。结论1.食管鳞癌组织存在特征性菌群,以厚壁菌门及变形菌门为主。2.食管鳞癌患者唾液中的菌群主要以变形菌门及拟杆菌门为主,且发现22个菌属丰度增高,3个菌属丰度降低。。3.在食管鳞癌患者的肿瘤组织内和唾液内菌群存在着差异,说明宿主及局部环境在细菌群落结构中起着重要作用。