研究背景:多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma,MM)是一种血液系统恶性肿瘤,恶性浆细胞增殖性疾病,肿瘤细胞起源于骨髓中的浆细胞,位列第二大血液系统恶性肿瘤,仍不可治愈。MM多发于40岁以上,特别是60岁以上的老年人,常伴有高钙血症、溶骨性损害、免疫缺陷及肾脏损害等。2018年,全球185个国家调查显示,MM发病率约占全部肿瘤的0.9%,死亡率为1.1%,2019年,预计美国MM患者发病率高达1.82%,死亡率为2.14%。目前,我国在MM基础研究、临床治疗等领域与发达国家相比,还处于跟跑、追赶阶段,尚无官方统计的全国MM流行病学调查数据。随着我国人口老龄化,人民生活水平提高,MM发病率逐年升高,己经超过急性白血病,位居血液系统恶性肿瘤发病率的第二位。近年来,治疗MM新疗法的不断涌现,蛋白酶体抑制剂,免疫调节剂,单克隆抗体以及CAR-T(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy,嵌合抗原受体T细胞免疫疗法)等免疫疗法均取得巨大进展。药物疗效不断提高,预后不断改善,客观上带动了MM治疗新药市场的增长。令人遗憾的是,除CART免疫疗法外,我国在MM“一类创新药物”上基本属于空白。此外,中医对多发性骨髓瘤的认知自古有之,多将其归于“骨痹”等范畴,认为本病以肾虚为本,血瘀毒蕴为标,治疗上要注意标本兼治,辨病与辨证结合。但是中医对多发性骨髓瘤也不能做到彻底根治,缺乏有效的治疗方案与药物。目的和意义:迄今,大部分MM患者病情获得完全缓解,患者整体生存期从最初的1-2年,大幅提升至7-8年。然而,复发、耐药仍是MM临床面临的主要问题。究其原因为MM伴有复杂的遗传学改变,如染色体异常及不稳定性、分子遗传学异常如癌基因活化、非编码RNA如环状RNA等改变,以及骨髓微环境中破骨细胞恶性增殖分化引发的免疫抑制和溶骨性病变等,这些变化均与骨髓瘤进展密切相关。因此,揭示骨髓瘤病理进程中遗传学改变,发现全新的诊断与治疗靶标,开发具有我国自主知识产权的创新药物刻不容缓。另外,也期待通过中医理论结合西医手段,加深对MM疾病的认知,更好的寻找到治疗MM的方法。研究方法:近年来,基于MM患者及模式动物基因大数据文库,课题组前期通过高通量筛选并鉴定了一系列与MM患者染色体不稳定性(Chromosomal Instability,CIN)、增殖及耐药相关的致癌基因,我们发现CHEK1基因与MM患者预后、CIN以及肿瘤微环境骨破坏密切相关。细胞有丝分裂检验点激酶1(checkpoint kinase 1,CHEK1)属丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员,位于染色体11q24,编码476个氨基酸。CHEK1蛋白激酶包含四个结构域:N端激酶结构域、可变连接域、SQ/TQ调节域和C端抑制性结构域。CHEK1蛋白激酶在细胞周期调控和DNA损伤反应中发挥至关重要的作用。本课题通过基因芯片技术比较MM患者和正常以及意义未明单克隆免疫球蛋白血症患者(monoclonal gammopathy,MGUS,MM前体疾病)浆细胞CHEK1基因的表达水平,收集并分析MM TT2(Total Therapy 2)治疗方案患者临床数据,比较发生溶骨性病变的MM患者和全身核磁共振未检出溶骨性病变的患者MM细胞中CHEK1基因表达水平,比较MM患者复发前后对应样本及不同治疗阶段中CHEK1基因表达水平,通过TT2、APEXS数据库比较高表达CHEK1的复发患者与CHEK1低表达患者生存周期的差异,证实CHEK1基因与MM患者病程发展、溶骨性病变以及生存周期之前的密切联系。紧跟着,我们构建了CHEK1过表达及敲低的MM细胞株,从细胞水平验证CHEK1对MM细胞增殖、耐药的影响,同时通过流式细胞术、吉姆萨染色、免疫荧光、外显子测序等方法检测CHEK1对细胞周期、细胞CIN的影响。通过免疫共沉淀技术等,揭示CHEK1调控细胞分裂、CIN的机理。诱导破骨细胞分化实验验证CHEK1对骨髓微环境中破骨细胞分化的调控作用,通过破骨细胞标志性细胞因子水平检测,研究寻找CHEK1调控破骨分化的作用通路,尝试从对骨破坏的影响这一角度解释CHEK1在MM复发与耐药中扮演的角色。最后,挑选特异性靶向CHEK1的天然化合物单体修饰物,抑制MM细胞中CHEK1蛋白质的表达水平,检测CIN及破骨细胞分化进程的变化,反向论证CHEK1在CIN及破骨分化中的作用,也为开发靶向CHEK1的药物提供一定的理论支持。实验结果:我们通过分析22例正常人骨髓、44例意义未明单克隆免疫球蛋白血症患者以及351例MM初诊患者浆细胞基因芯片数据,发现CHEK1基因的表达水平在MM患者中明显高于正常以及MGUS患者。分析MM TT2治疗方案患者临床数据发现,发生溶骨性病变的MM患者MM细胞中CHEK1基因表达水平显著高于全身核磁共振未检出溶骨性病变的患者。另外,CHEK1表达高的MM患者存活率明显低于CHEK1低表达患者。同时,在88例MM患者复发前后对应样本中,相较于初诊样本CHEK1基因在复发样本中表达明显升高。分析9例病人初诊、第一次骨髓移植前、第二次骨髓瘤移植前以及第二次骨髓瘤移植后的序贯样本,我们发现随着治疗进程的进行,CHEK1基因表达水平逐步升高。此外,TT2、APEXS数据库显示,高表达CHEK1的复发患者,生存周期明显低于CHEK1低表达患者。Western Blot结果显示CHEK1过表达细胞株CHEK1蛋白质表达量高于野生型细胞株。连接有tet开关的敲低细胞株,加入多西环素诱导的细胞株中CHEK1表达量低于未加的细胞株。台盼蓝计数及软琼脂克隆实验结果显示CHEK1过表达的MM细胞株增殖速率及克隆形成率明显高于野生型,敲低CHEK1后MM细胞增殖减慢,克隆形成率降低。流式细胞术对细胞周期分析结果显示,CHEK1过表达细胞株G2/M期比例显著高于野生型细胞株,敲低CHEK1后G2/M期比例降低。MTT检测IC50发现CHEK1过表达细胞株对BTZ和DOX的IC50值显著高于野生型细胞。Western blot检测结果显示CHEK1过表达细胞株耐受BTZ和DOX诱导的凋亡,且耐药MM细胞株中CHEK1表达量高于敏感株。吉姆萨染色、纺锤体免疫荧光染色、外显子测序等方法显示CHEK1过表达可以导致MM细胞核数目增加,赤道板宽度变宽,纺锤体长度变短,染色体片段缺失与重复加剧。免疫共沉淀技术结果表明CHEK1可以结合并磷酸化中心体蛋白CEP170。诱导破骨细胞分化实验证实CHEK1可以促进巨噬细胞分化成破骨细胞,Co-IP结果显示CHEK1可以结合并调控破骨细胞分化相关因子NFATC1。天然化合物单体修饰物中的CHEK1抑制剂可以促进MM细胞凋亡,抑制CHEK1诱导的中心粒相关蛋白CEP170和NEK2的表达,缓解赤道板宽度和纺锤体长度的改变,减缓CHEK1诱导的破骨分化进程。结论:CHEK1基因与MM患者病程发展、溶骨性病变以及生存周期密切相关,MM进程加剧,溶骨性病变加重,CHEK1的基因水平越高,病人生存周期越短。体外细胞实验表明CHEK1可以促进MM细胞增殖、引发MM细胞耐药。CHEK1高表达引起MM细胞CIN可能是导致MM细胞耐药的关键因素,而CIN的发生则可能受到CEP170及NEK2等中心体相关蛋白表达量及磷酸化水平的调控。CHEK1可以结合并调控分化相关因子NFATC1,并可能通过磷酸化激活NFATC1信号通路,促进破骨细胞的分化,加剧骨破坏。天然化合物单体修饰物LY2603618能够抑制CHEK1蛋白质的表达,下调CEP170及NFATC1的蛋白表达水平,通过下调CHEK1引发的CIN增加降低MM细胞的耐药性,通过减缓破骨细胞分化进程干预MM病人的骨破坏。本课题研究结果为CHEK1作为MM诊断和治疗的分子靶标提供了更充分的理论依据。