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大气压介质阻挡放电(DBD)等离子体中含有大量的电子、离子、激发态原子和分子及自由基等活性粒子,以及电场、紫外线,能在较短时间内达到很高的灭菌效率,并不损害灭菌物质表面结构,同时具备低温、易操作等优点,受到越来越多的关注。然而DBD等离子体对微生物的作用机理还不是很清楚,将其用于诱变微生物的相关研究工作开展较少,尤其是诱变真菌尚未见报道。本论文着重研究了大气压DBD空气等离子体对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的生物学效应以及对产乙醇菌株S. cerevisiae ATCC 4126和Candida shehatae CICC1766的诱变效应,主要研究结果如下：1.等离子体处理对酵母细胞具有显著的生物学效应。大气压DBD空气等离子体在均方根(root-mean-square, RMS)放电电压为12.0 kV,频率为20 kHz,放电间隙为4 mm,处理S. cerevisiae菌液深度为2 mm的条件下,引起酵母细胞在短时间内大量死亡。通过吉姆萨染色发现等离子体处理时间越长,细胞着色越深；S. cerevisiae胞外蛋白质和核酸含量随着处理时间的延长显著增加,表明等离子体可能破坏了酵母细胞的细胞膜,引起细胞通透性增加,导致胞内蛋白质和核酸渗漏到胞外。同时,等离子体处理引起细胞生长延迟,细胞周期阻滞于G1期,表明DNA可能受到损伤。2.等离子体诱导酵母细胞的氧化应激。等离子体处理不仅能使去离子水中的活性氧化物含量显著增加,而且也使S. cerevisiae胞内的活性氧物质(reactive oxygen species, ROS)含量显著增加,酵母胞内、外总抗氧化能力(total antioxidant capability, T-AOC)和胞内谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase, GR)活力都有不同程度提高,丙二醛含量也随着处理时间的延长而不断增加。等离子体处理后再将细胞培养3h,胞内超氧化物歧化酶(superoxide dismutases, SOD)和过氧化氢酶(catalase, CAT)比活力依然增强。这些结果表明,DBD空气等离子体对酵母菌产生了一定的氧化损伤,并引发酵母细胞的氧化应激。除了直接作用于细胞表面导致细胞损伤甚至死亡外,等离子体引起的细胞内氧化应激也可能是引起细胞损伤、甚至死亡的重要原因之一。3.等离子体对酿酒酵母产乙醇能力的刺激效应。用DBD空气等离子体处理S.cerevisiae菌,筛选耐高温、耐高浓度底物的高产乙醇菌株。将等离子体处理4 min筛选的单菌落接种到葡萄糖浓度为30g/L的培养基中,在40℃下培养,获得8株具有正效应的菌株,其乙醇产量较对照菌株提高13.7～40.4%。正效应菌株在葡萄糖浓度为100 g/L的培养基中370C下培养作进一步的验证,其中的5株菌仍保持良好的乙醇生产性能,乙醇产量分别比对照提高了2.5～6.6%；提高培养温度和底物葡萄糖的初始浓度作进一步的筛选,在葡萄糖初始浓度分别为100 g/L和300 g/L的培养基中40℃培养,发现先前的几株菌未显示出高产乙醇的优势,而重新诱变筛选出的菌株则表现出高产特性,但经多次传代培养后,高产性状丧失。这些结果表明等离子体对S. cerevisiae菌体有一定的激活作用,可以获得耐高温、耐高浓度底物并高产乙醇的正效应菌株,但获得稳定遗传的正突变菌株还有待进一步研究。4.等离子体对利用木糖产乙醇的休哈塔假丝酵母细胞的诱变效应。用DBD空气等离子体处理C. shehatae CICC1766,诱变、筛选高效利用木糖生产乙醇的菌株。经过TTC指示剂法平板筛选和摇瓶发酵实验的验证,继代培养15次获得3株性状变化明显且稳定遗传的突变株,分别命名为C80828, C81015和C81020。其中C80828, C81015为正突变株,在TTC平板上显色比野生菌株深,在木糖培养基中的乙醇产量也显著高于野生型菌株。在50g/L木糖发酵培养基中,到发酵至120 h时,C80828的乙醇产量比对照高出8.2%；C81015的产量高出36.2%(P<0.05)。但C81015的生物量明显低于对照,表明C81015细胞的比乙醇生成速率显著提高。研究发现C81015中NADH/NADPH-木糖还原酶(xylose reductase, XR)和NAD+-木糖醇脱氢酶(xylitol dehydrogenase, XDH)比活力分别比对照提高了34.1%(P<0.01),61.5%(P<0.05)和66.3%(P<0.01)。而以葡萄糖为底物时,C81015的乙醇产量几乎与野生菌株相同,表明DBD空气等离子体影响C. shehatae木糖代谢关键酶XR和XDH的活力,从而影响C. shehatae突变株利用木糖产乙醇的能力。而菌株C81020为负突变株,与野生菌株相比,以木糖为底物产乙醇的量很低,两个关键酶活力也显著降低,但生物量有所提高。SDS-PAGE分析表明其胞内总蛋白图谱与野生型明显不同,表明等离子体可能对该菌株产生了遗传毒性。5.等离子体对木糖利用关键酶的突变效应。对突变株C81015和野生菌株木糖还原酶和木糖醇脱氢酶的基因XYL1和XYL2的序列进行检测和比对。序列比对结果发现,与野生型菌株相比,突变株C81015 XYL1中有3个碱基不同,从野生型菌株到突变株C81015的碱基改变(ATT→GGT, AAT→AAG)导致了氨基酸残基的变化(Ile309→Gly309, Asn314→Lys314)。而在XYL2序列对比中发现,突变株C81015与野生型有6处碱基不同,分别位于序列的前、中、后部。其中基因序列中部碱基的不同(AGT->GGT, TTC→CTC)导致了氨基酸残基变化(Ser185→Gly185, Phe189→Leu189)。而位于基因序列前、后部的不同碱基并未引起相应位置氨基酸残基的改变。总之,DBD空气等离子体产生的ROS是导致酵母损伤以及死亡的重要原因之一。DBD空气等离子体能引起酵母细胞的氧化应激,导致胞内DNA和蛋白质损伤、基因的改变。因此DBD空气等离子体除了应用于物质的表面灭菌外,还能用来诱变S. cerevisiae和木糖利用菌株C. shehatae,来筛选高产乙醇的突变株。