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植物在其一生的生长过程中将会受到各种各样外界因素的影响,其中包括生物胁迫和非生物胁迫。干旱就是植物面临的一种较为常见的非生物胁迫,在植物受到干旱胁迫时,转录因子就会启动调控某些与抗干早相关的基因,使之进行一系列的转录、翻译就会产生对细胞起到保护作用的蛋白质。拟南芥WRKY57基因是应答干旱胁迫时的重要调控基因之一,在植物应答干旱胁迫方面起着不可替代的作用。表现为可以激活许多逆境诱导基因的表达,增强植物对干旱逆境的抵抗力。磷酸甘露糖异构酶基因(PMI)是生物安全标记基因,减少了抗生素或除草剂抗性带来的对环境的危害。本次研究采用Gateway技术,以生物基因磷酸甘露糖异构酶基因PMI为安全筛选标记,构建了拟南芥WRKY57基因的过表达载体,在露地菊‘火焰’离体再生体系建立的基础上将拟南芥WRKY57基因转入到露地菊中,为实现具有安全标记的抗干旱性状的到改良的露地菊品种奠定了基础。研究结果如下:(1)基因克隆:利用RT-PCR的方法克隆了拟南芥WRKY57基因,其cDNA序列全长为1141 bp,包含了一个完整的开放阅读框为915 bp,编码304个氨基酸,基因编码的蛋白分子式是C1471H2272N430O482S11,分子量为34045.4,理论等电点(pI)为6.22。其不稳定系数为52.84(>40),属于不稳定蛋白,亲水性蛋白。(2)过表达载体的构建:利用Gateway技术构建pCAMBIA1301-PMI-AtWRKY57植物过表达载体,在经过PCR结果和酶切验证后,确定成功的构建了过表达载体,将构建成功的植物过表达载体电转化农杆菌EHA105中,提取质粒通过PCR方法验证pCAMBIA1301-PMI-AtWRKY57植物表达载体已成功转入农杆菌EHA105中。(3)露地菊‘火焰’的遗传转化:选取健壮的露地菊‘火焰’的脚芽,经次氯酸及酒精消毒后接种于MS培养基上,获得无菌的露地菊幼苗,待生长到1-2个月后,以叶片作为外植体,剪切成8mm×8mm大小的叶片,经过2天预培养小叶片作为转化材料,将农杆菌菌液摇至OD600=0.6对叶片进行侵染1Omin,然后在25℃黑暗的条件下进行共培养2天,以头孢霉素100 mg/L的浓度为抑菌浓度,之后转入到含有甘露糖浓度为8g/L的前期培养基中,带长出不定芽的时,将不定芽接种到甘露糖浓度为10g/L的后期筛选培养基中,最后将其转入到甘露糖浓度为12 g/L的生根培养基中,直至长势良好并生根的抗性植株产生。(4)实验共获得抗性苗219株,经过PCR鉴定后获得7株。其转化效率是3.2%