【摘 要】
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目的:胸腺是T细胞分化发育的重要场所,其中胸腺上皮细胞（thymic epithelial cells,TECs）是胸腺重要的组织细胞。在机体发生严重感染、肿瘤的放化疗、应激和器官移植排斥反应发生时常伴有胸腺的急性萎缩和退化,严重影响机体的免疫功能。其中有关胸腺萎缩的免疫机制,尤其是TECs的自然衰老与退化的机制还没有一个明确的解释。当严重感染、肿瘤发生与放化疗、基因突变等内质网应激因素存在时,可
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目的:胸腺是T细胞分化发育的重要场所,其中胸腺上皮细胞（thymic epithelial cells,TECs）是胸腺重要的组织细胞。在机体发生严重感染、肿瘤的放化疗、应激和器官移植排斥反应发生时常伴有胸腺的急性萎缩和退化,严重影响机体的免疫功能。其中有关胸腺萎缩的免疫机制,尤其是TECs的自然衰老与退化的机制还没有一个明确的解释。当严重感染、肿瘤发生与放化疗、基因突变等内质网应激因素存在时,可导致大量新生的蛋白无法进行正确的折叠。有文献表明,由内质网接头蛋白Sel1L（suppressor/Enhancer of Lin-12-like,Sel1L）构成的内质网相关降解复合体（endoplasmic reticulum associated degradation,ERAD）对于胞内未正确折叠或错误折叠的蛋白具有重要的清除功能。而有关胸腺上皮细胞中ERAD在维护胸腺组织结构及功能中的作用尚不清楚。本课题通过构建胸腺上皮细胞特异性敲除Sel1L基因小鼠模型,初步探讨了ERAD缺失对胸腺上皮细胞调控胸腺T细胞分化发育的影响,此结果对阐明因继发因素引起胸腺退化所致T细胞免疫缺陷的重建具有重要的理论意义和潜在的临床应用价值。方法:1.TECs中特异性敲除Sel1L基因小鼠模型构建利用Cre-Loxp条件敲除,将Foxn1-cre+/-小鼠和Sel1L f/f小鼠配种繁殖,并采用聚合酶链式反应和琼脂糖凝胶电泳技术检测,基因型为Foxn1Cre+/-Se1l Lf/f的小鼠为胸腺上皮细胞内Sel1L基因特异性敲除的模型小鼠（Knockout mouse,KO）,同窝基因型为Foxn1Cre-/-Se1l Lf/f作为对照组的野生型小鼠（Wildtype mouse,WT）。2.TECs特异性敲除Sel1L基因小鼠胸腺的组织学取6-8周龄的WT和KO小鼠,称量体重。取胸腺,称量胸腺重量,评估胸腺大体形态,并将胸腺组织包埋切片,进行H＆E与荧光染色,进一步分析其组织结构。3.Sel1L分子缺失对胸腺上皮细胞亚群的影响采用流式细胞术对Sel1L分子缺失的TECs进行初步分析,评估其细胞及亚群比例的变化。4.TECs中Sel1L基因缺失对小鼠胸腺T细胞发育及亚群的影响运用荧光染色流式分析TECs特异性敲除Sel1L基因小鼠胸腺T细胞发育不同阶段及各亚群的影响。5.胸腺上皮细胞Sel1L基因缺失对小鼠外周T细胞亚群的影响运用流式细胞术分析WT和KO小鼠外周T细胞各亚群比例的影响。6.免疫组学测序磁珠分选WT和KO小鼠脾脏CD4+T细胞,利用二代测序技术,对其TCR进行测序分析,评估T细胞TCR克隆多样性。结果:（1）TECs中Sel1L基因特异性敲除小鼠模型构建成功,聚合酶链式反应及琼脂糖凝胶电泳鉴定小鼠基因型。自然繁殖到第二代小鼠为纯合Sel1Lf/f子代;基因型为Foxn1-cre+/-Se11Lf/f是Sel1L KO小鼠,基因型为Foxn1-cre-/-Se11Lf/f是WT小鼠。（2）KO小鼠与WT小鼠相比,胸腺重量、胸腺指标和胸腺细胞总数发生了明显的降低。（3）Sel1L基因敲除后小鼠胸腺发生了严重的萎缩,H＆E切片染色及流式细胞术分析表明,胸腺上皮细胞绝对值降低,髓质胸腺上皮细胞比例降低更为严重。（4）胸腺上皮细胞中特异性敲除Sel1L基因后,胸腺细胞总数显著降低,胸腺中CD8+T细胞比例降低。胸腺细胞其余各亚群比例变化不明显,但细胞数降低。（5）WT和KO小鼠脾脏、外周血中T淋巴细胞的比例无明显变化,但CD4+T和CD8+细胞的TCR多态性降低,克隆性增加。结论:内质网接头蛋白Sel1L在胸腺上皮细胞中特异性缺失,导致小鼠在其生长的早期即发生胸腺的严重萎缩和退化,胸腺上皮细胞及胸腺细胞数总数及比例明显降低。外周的T细胞亚群比例无明显改变,但外周中CD4+T以及CD8+T细胞TCR多样性降低,导致机体免疫功能的降低。
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