宫颈癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,在世界范围内发病率居第二位,仅次于乳腺癌,每年约有超过50万新发病例。2007年有25万人因此丧生,其中80%的病例发生在发展中国家。中国每年约有新发病例13.15万,占世界新发病例的30%。近年来,宫颈癌的发病年龄趋向年轻化,成为严重威胁中青年妇女健康的重大妇科肿瘤之一。通过大量的临床、分子生物学及流行病学研究,人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)已被证实是引起宫颈癌及宫颈上皮内瘤变(CIN)的主要病因。女性中HPV感染非常普遍,多数可自然清除,仅少数持续性感染,并可发展为CIN,最终进展为浸润性宫颈癌。宫颈癌主要的病理类型有宫颈鳞癌和腺癌,HPV 16与宫颈鳞癌有关,HPV 18与宫颈腺癌有关,但宫颈癌发生的具体分子机制尚不明确。微小RNA(microRNA, miRNA)是一类长约22个核苷酸的单链非编码RNA,通过与靶mRNA完全或不完全互补配对,导致靶基因降解或抑制其翻译,从而在基因的表达调控中发挥着重要作用。miRNA参与了动植物许多复杂的生命过程,包括发育、器官形成、凋亡和细胞增殖等。研究表明,miRNAs表达异常与恶性肿瘤发生关系密切,miRNAs很可能是一类潜在的癌基因或抑癌基因。最近有研究(1)发现HPV 16阳性的细胞系、宫颈损伤和宫颈癌组织与正常宫颈组织、HPV阴性的宫颈癌细胞系相比,miR-218的表达存在差异,提示miR-218的表达失衡可能参与了宫颈癌的发病过程。目前国内外尚无miR-218与宫颈癌恶性程度相关性的报道,而且文献报道的miR-218在宫颈癌中的表达只检测了HPV16阳性细胞株和少数几例宫颈癌标本,并且这种检测只是局限于组织中。而血清作为生物检测样本,具有取材方便,无创伤性,可连续体外检测的优点,且血清miRNA的高度稳定性也使得病人的实际值与实验的测试值相当吻合。因此有必要深入开展miR-218在宫颈癌中的表达和功能研究,以及对血清中的表达进行检测,为深入研究宫颈癌的发病机理、早期诊断和治疗提供一种新的理论与实验基础。基于此,本课题的研究内容包括以下两部分：第一部分miR-218的表达水平与宫颈癌恶性程度的相关性背景和目的：宫颈癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一。在15种致癌性HPV病毒中,HPV 16最为常见,HPV 16阳性宫颈癌在所有宫颈癌中所占比例超过了50%。与正常宫颈组织、HPV阴性的宫颈癌细胞系相比,HPV 16阳性的宫颈癌细胞系、宫颈损伤和宫颈癌组织中miR-218特异性低表达。在本研究中,我们检测了正常宫颈组织、宫颈癌细胞系、癌前病变和宫颈癌中miR-218的表达状况,检测了宫颈癌患者血清中miR-218的表达水平,旨在探讨miR-218的降低程度与感染的HPV型别、宫颈癌恶性程度的关系,探讨宫颈癌组织和血清中miR-218表达水平的相关性,以及探讨血清中miR-218的表达水平能否反映宫颈癌的恶性程度,为以后的早期诊断提供一种实验基础。材料和方法：本研究收集了22例子宫肌瘤患者的正常宫颈组织作为对照组,收集了78例宫颈癌患者手术标本、22例石蜡包埋标本和18例宫颈癌患者的血清标本作为实验组,检测了miR-218在正常宫颈组织、宫颈癌细胞系、癌前病变和宫颈癌中的表达,采用导流杂交法检测了感染的HPV的型别,探讨了miR-218的表达水平与HPV型别、宫颈癌恶性程度的相关性。对于收集到的部分宫颈癌患者的血清标本,我们分离得到了小分子RNA,检测了miR-218的表达,使用Pearson’s相关系数描述了组织和血清中miR-218表达水平的相关性。结果：1.我们成功建立了检测miR-218表达的实时定量RT-PCR方法(UPL法),确定了其检测的线性范围。2.验证了HPV 16阳性细胞系SiHa中miR-218的低表达。检测到在HPV 18阳性的细胞系HeLa中,miR-218也呈低水平表达。3.高危型HPV感染的组织标本中miR-218表达低于低危型组织标本和对照组标本,低危型感染组与对照组中miR-218表达水平的差异无统计学意义。4.在正常组织、CIN和宫颈癌中,miR-218由高到低依次是：正常组织>CINⅠ>CINⅡ～Ⅲ>宫颈癌；而且,miR-218在宫颈癌患者血清中也呈低水平表达,与组织中的低表达存在相关性。结论：1.HPV 18(+)的宫颈癌细胞系HeLa中miR-218呈低水平表达。2.宫颈癌和癌前病变中,高危型HPV感染组织中miR-218呈低水平表达。3.随着宫颈癌恶性程度的升高,miR-218的表达水平呈进行性降低,这种降低可以反映在血清中。第二部分miR-218在宫颈癌发病机制中作用的初步探讨背景和目的：miR-218与宫颈癌的恶性程度密切相关,但在宫颈癌发病机制中所起的作用尚不清楚。本研究在体外人为改变宫颈癌细胞株中miR-218的表达,检测其对细胞生物学活性的影响,并初步探讨其影响机制。材料和方法：在脂质体siPORT NeoFX的介导下,将Pre-miR miRNA Precursor、Anti-miR miRNA Inhibitors以及对应的阴性对照分别转染入C-33a、SiHa和HeLa细胞株中,检测不同时间点miR-218表达水平的改变,用MTT、流式细胞术检测其对各组细胞的增殖、凋亡、细胞周期的影响,用RT-PCR方法检测了P13K调节亚单位p85 mRNA的表达,并用Western blotting检测了转染前后p85,Akt及p-Akt的表达。结果：1.我们成功地将miR-218转染入SiHa细胞,转染后24小时,miR-218水平改变最为显著,随时间的延长,逐渐趋向正常水平。2.在转染后的24小时,miR-218水平升高可促进SiHa, HeLa细胞增殖,抑制细胞凋亡；miR-218水平降低可抑制SiHa、HeLa的增殖,对细胞凋亡有促进倾向,但无统计学意义。在转染后的48,72小时,这种促进或抑制作用消失。miR-218表达水平的改变对SiHa、HeLa细胞的细胞周期均无影响。对于C-33a,miR-218的表达水平改变对其增殖、凋亡和细胞周期均无影响。3.miR-218水平升高可促进P13K调节亚单位p85a蛋白的表达和下游效应蛋白Akt的磷酸化,反之抑制p85蛋白的表达和Akt的磷酸化,对p85a mRNA的表达无影响。结论：虽然miR-218随着宫颈癌恶性程度的升高而表达降低,但是体外实验表明升高miR-218的表达水平对肿瘤细胞系SiHa、HeLa的生长表现出促进作用,降低miR-218的表达对SiHa、HeLa的生长表现出抑制作用,而且只有当miR-218处于高浓度时才表现出这些作用,这说明miR-218对肿瘤细胞作用的复杂性,需要进一步进行体内实验才能充分体现出它的作用。