本试验以探讨“失水胁迫对花瓣内肽酶活性和种类的诱导及其对月季切花失水胁迫耐性的影响”为目的。首先选用耐失水品种‘Samantha’和中度耐失水品种‘Belami’,并且以创造不同的胁迫程度为目的,分别进行了带枝花和离枝花两种方式下的失水胁迫处理,采用分光光度法测定了内肽酶的活性与种类,在此基础上,以‘Samantha’为试材,进行反复失水胁迫处理,通过底物胶电泳法进一步探讨了失水胁迫对内肽酶活性和种类的诱导。 1、两品种之间的比较研究表明: 1) 在0～60h失水胁迫过程中,带枝花花枝复水率出现由缓慢下降到快速下降的拐点,‘Samantha’(30h)晚于‘Belami’(24h);两品种花朵水势对应于复水率拐点呈现高度吻合的由快速下降转向缓慢下降的转折点。 2) 两品种花瓣内肽酶活性诱导上升的转折点与其相应的复水率迅速降低的拐点相一致。胁迫诱导引起的花瓣中金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶活性的变化均是‘Samantha’显著低于‘Belami’。 离枝花获得了与带枝花的一致的结果。 由此说明,切花月季品种间失水胁迫耐性差异可能与胁迫对花瓣中金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶活性诱导的差异有关。对‘Samantha’的诱导显著低于‘Belami’,这可能是‘Samantha’较‘Belami’耐失水的原因之一。 2、‘Samantha’反复失水胁迫处理结果表明: 1) 失水胁迫24h后,经6h复水,花颈弯曲状况能够恢复到正常状态,同时花朵水势能够恢复到胁迫前的水平,但是花枝鲜重和花瓣内肽酶活性却在复水12h才基本上恢复到胁迫前水平;再次失水胁迫,花枝形态和花朵水分状况都表现出与第一次胁迫相近的变化,但是花瓣内肽酶活性较第一次胁迫过程中的变化更剧烈,上升幅度更大。 2) 花瓣中丝氨酸蛋白酶活性的迅速增加与切花的衰老紧密联系;失水胁迫强烈诱导了丝氨酸蛋白酶活性,失水胁迫18h,其活性就和自然衰老过程中萎蔫期(6级)时的相同,复水6h仍不能明显下降,再次失水胁迫6h其活性就已经达到萎蔫期(6级)时的水平;ABA预处理减轻了失水胁迫的征状,水势的降低、鲜重的损失及内肽酶活性的水平都显著被抑制。 3) 试验中对月季切花花瓣内肽酶底物胶电泳测定方法进行了优化,结果表明,花瓣蛋白粗提液通过Sephadex G-25柱子去盐去色素等杂质后,在40℃下前处理10min,然后用12%分离胶(含有0.15%明胶)进行分离,复性完成后温育16h,内肽酶的酶解条带在蓝黑色的凝胶背景上清晰出现。 4) 底物胶电泳法结果显示,失水胁迫诱导的内肽酶与衰老相关的内肽酶谱带相同,共有3条,分子量从大到小依次大约为200 kDa、123.5 kDa、97.4 kDa,分别命名为EP1、EP2、EP3,其中EP2、EP3与衰老关系更为密切。EP1、EP2、EP3的最适反应温度是42℃;EP1的适宜pH在酸性到中性范围内,EP2和EP3在中性到碱性范围内,pH7时三者活性都能明显表现;EP2和EP3是丝氨酸蛋白酶,EP1可能是金属蛋白酶。