背景现今全世界1/6以上的人口遭受着持续或反复发作的慢性疼痛的折磨,生活质量受到严重影响。其中神经病理性疼痛,由于病程长、病因复杂和机制不明确的因素,导致目前针对它的治疗方法,包括神经阻滞治疗、外科治疗和物理疗法等均难以让人满意。寻找有效安全的治疗方法成为研究热点。2011年国际疼痛研究协会对神经病理性疼痛给出新定义：神经病理性疼痛是指躯体感觉神经系统的损伤或疾病所引起的疼痛。脊髓背角(spinal cord dorsal horn, SCDH)作为外周神经损伤进展为高级中枢病理改变的中间桥梁,是神经病理性疼痛中枢致敏的关键因素,也一直是神经病理性疼痛药物治疗研究的靶点。其中,神经元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase, nNOS)在脊髓背角的过度表达,是神经病理性疼痛发生发展机制里的重要环节。外周神经损伤可导致脊髓背角神经元nNOS的过度表达,并伴有痛觉异常和痛觉过敏。全身或局部鞘内注射非特异性NOS抑制剂或选择性nNOS抑制剂,可以脊神经结扎或缓解坐骨神经慢性压迫模型中神经病理性疼痛的痛敏反应；而nNOS基因敲除鼠没有表现出神经损伤所诱导的机械痛敏。机体神经受到损伤,伤害性刺激信号传入到脊髓,产生过量兴奋性氨基酸与NMDA受体结合,激活NMDA受体,促进Ca2+内流从而激活nNOS。一方面通过催化L-精氨酸产生的一氧化氮(nitric oxide, NO),另一方面通过蛋白结构域与NMDA受体和突触后蛋白PSD等物质相互作用。nNOS参与了多种神经生理和病理过程,包括参与突触传递、可塑性的调节、海马的长时程增强、神经元的凋亡与再生、介导神经损伤和神经变性过程[虮。这种初级感觉神经元的病理改变,引起初级中枢敏化和突触重塑,最后导致高级中枢大脑皮层持久性功能改变。以小干扰RNA (small interference RNA, siRNA)沉默nNOS过度表达或成为治疗神经病理性疼痛的有效途径。但由于缺乏可靠的基因载体,siRNA基因治疗的临床应用仍然受到极大限制。近年来,细胞穿透肽(cell penetrating peptides, CPPs)作为基因传递工具受到广泛关注,CPPs能将siRNA等以非受体依赖的方式导入胞内发挥生物学效应。HIV-Tat (HIV transactivator of transcription)是人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)基因编码的反式转录激活因子,是当前最受瞩目、研究最为深入的CPPs之一。富含碱性氨基酸的多肽片段,具有CPPs的穿膜活性,能将与之连接的基因片段高效快速地导入胞内,且不影响细胞的正常结构和功能,具有转染效率高、毒性低、稳定性好等优点。第49-57位(RKKRRQRRR)9个氨基酸是其发挥穿膜功能的核心序列。Alain Pluen等发现Tat核心序列经膜活化多肽LK15 (KLLKLLLKLLLKLLK)修饰融合形成的细胞穿膜肽Tat-LK15,其运载siRNA转染细胞的能力得到极大改善。因此,Tat-LK15或许可以作为一种良好的siRNA运载工具,明显优化RNA干扰技术在治疗神经病理性疼痛等方面的应用。我们推测Tat-LK15可以成为神经系统生物应用的良好基因载体。目的通过探讨离体条件下细胞穿透肽Tat-LK15介导siRNA对神经细胞的转染效率,细胞毒性和干扰效能,为Tat-LK15作为基因载体为介导基因治疗提供理论依据。进而探讨细胞穿透肽Tat-LK15介导siRNA干扰大鼠脊髓背角nNOS表达治疗神经病理性疼痛的可行性,为神经病理性疼痛的基因治疗提供新思路新策略。方法1.细胞穿透肽Tat-LK15介导siRNA的转染效率和细胞毒性初步研究。根据Alain Pluen Tat-LK15序列为RKKRRQRRRGGGKLLKLLLKLLLKLLK,由厦门博欣生物生物科技有限公司合成,检测纯度为86.59%。通过与LipofectamineTM RNAiMAX(Lipo)比较,探讨细胞穿透肽Tat-LK15对人肾上皮细胞(human embryonic kidney 293T cells,293T)和大鼠视神经节细胞(retinal ganglion cell line,RGC-5)转染siRNA的效率和细胞毒性。①.Tat-LK15和siRNA以质量比为1：3、1：2、1：1、2：1、3：1混合孵育后经20%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,通过凝胶阻滞分析测定Tat-LK15与siRNA的最佳交联比。②.以羧基荧光素(Carboxyfluorescein,FAM)标记的siRNA为报告基因,Tat-LK15与siRNA的质量比分别为1:2、3:4、1:1、4:3、2:1(μg/μg),Lipo与siRNA剂量比分别为1:1、2:1、3:l、4:1v5:1(μL/μg),转染293T和RGC-5两种细胞。转染24h后,倒置荧光显微镜检测FAM显色并拍照,计算转染效率：每孔寻找3个代表性视野,各观察100个细胞,计算阳性细胞率。并以CCK-8法检测同等浓度下细胞存活率评估Tat-LK15细胞毒性。2.离体条件下细胞穿透肽Tat-LK1 5运载siRNA沉默RGC-5细胞神经元型一氧化氮合酶(nNOS)基因的表达。①.Tat-LK15与FAM-siRNA质量比为3：4、1:1.2:1孵育转染RGC-5细胞,与LipofectamineTM RNAiMAx对照,流式细胞术检测Tat-LK15介导FAM-siRNA转染效率；于6孔板中不同剂量Tat-LK15(1μg、2.5μg、5μg、10μg和20μg)孵育RGC-5细胞24 h,流式细胞术检测细胞凋亡率。②.以缺氧缺糖(Oxygen-Glucose Deprivation,OGD)和高盐(浓度145 mmol·L-1)的处理方式制备nNOS高表达的细胞模型。将RGC-5细胞随机分为5组：对照组、模型组、Tat-S组(Tat-LK15运载nNOS/siRNA转染模型细胞)、Lipo-S组(LipofectamineTM RNAiMAX运载nNOS/siRNA转染模型细胞)及Tat-N组(Tat-LK15运载NCsiRNA转染模型细胞),通过Q-PCR及Western Blot检测各组细胞nNOS在mRNA和蛋白表达水平。3.细胞穿透肽Tat-LK15介导siRNA干扰大鼠脊髓背角nNOS表达治疗神经病理性疼痛。①. Tat-LK15介导FAM-siRNA转染原代大鼠脊髓背角神经元细胞(RN-dsc),倒置荧光显微镜观察其转染效果。②.健康雄性SD大鼠50只,随机分为5组(n=10)：正常组(Control,C组)、假手术组(Sham组)、神经病理性疼痛组(SNL组)、Tat-LK15 nNOS/siRNA组(TS组)和Tat-LK15 NCsiRNA组(TN组)。采用脊神经结扎法(SNL)制作神经病理性疼痛模型,C组不予任何处理,Sham组仅暴露脊神经；SNL组、TS组、TN组构建SNL模型同时鞘内置管,于第7d开始每天分别鞘内注射10μL生理盐水、10μL含5 μg siRNA的Tat-LK15 nNOS/siRNA和Tat-LK15 NCsiRNA,持续7天。建模前1d及建模后3、7、10和14 d,用Von Frey hair触觉测量套件测定各组大鼠50%机械性刺激缩足反应阈值(50%PWMT, g)的变化；用足底测试仪测定各组大鼠热刺激缩足潜伏期(PWTL, s);第14d测定结束后冰面上摘取L4-6节段脊髓背角,均分为两份,存放液氮中。采用荧光定量Q-PCR方法,检测各组大鼠脊髓背角中nNOS mRNA表达变化。采用western-blot的方法,检测各组大鼠脊髓背角中nNOS蛋白表达的变化。结果1.①.通过凝胶阻滞分析测定Tat-LK15与siRNA质量比为2：1时,Tat-LK15可完全包裹siRNA,达到最佳交联。②.随着Tat-LK15和Lipo剂量的增加,siRNA转染效率逐渐提高。与凝胶阻滞分析结果一致,当Tat-LK15与siRNA配比为2：1 (μg/μg)时,RGC-5细胞的转染效率达到最高[(87.3±4.5)%],但低于Lipo与siRNA配比为5:1(μg/μg)时的最高转染效率[(96.2±3.2)%(P<0.05)]；作用于293T细胞时,两转染试剂的最高转染效率Tat-LK15 (2:1)转染效率为(93.1±3.0)%与Lipo (5:1)组(98.2±1.6)%没有统计学差异(P>0.05)。转染试剂剂量增加,Lipo细胞毒性显著增加,而Tat-LK15毒性无明显变化。转染效率最高时,Lipo (5μL)组293T和RGC-5的细胞存活率仅为[(77.8±4.1)%,(73.4±7.7)%]显著低于Tat-LK15 (2:1)组同种细胞的存活率[(91.0±3.7)%,(90.0±6.1)%](P<0.05)。2.①.流式细胞术检测结果表明,Tat-LK15与FAM-siRNA (50 nmol·L-1)质量比为最佳交联比2：1(μg/μg)时,转染效率最高(84.4±3.9)%,低于Lipo5μL的(95.6±2.4)%(P<0.05)。当Tat-LK15剂量为20 μg (6.1 μmol·L-1)时才出现一定细胞毒性,细胞凋亡率高于对照组[(10.3±1.1)%vs(7.4±0.9)%,P<0.05]。②.经过缺氧缺糖高盐处理后RGC-5细胞nNOS蛋白表达显著增高(P<0.05)；单纯OGD处理nNOS表达无明显变化(P>0.05)。因此,缺氧缺糖高盐处理可以得到理想的nNOS高表达细胞模型。Tat-LK15 siRNA复合物转染模型细胞结果表明：与模型组相比,Tat-S组nNOS mRNA表达降低63.1%,蛋白表达降低58.9%,差异有统计学意义(P<0.05)。Tat-N组与模型组,Tat-S组与Lipo-S组nNOSmRNA及蛋白表达水平无显著差异(P>0.05)。3.①经神经细胞特异性物质微管相关蛋白2(MAP2)和DAPI免疫荧光细胞化学鉴定,在荧光倒置显微镜下观察大鼠脊髓背角神经元RN-dsc细胞：结果显示RN-dsc神经细胞鉴定纯度高；FAM-siRNA绿色荧光广泛分布,转染效率好。②.鞘内注射Tat-LK15 nNOS/siRNA复合物对神经病理性疼痛大鼠50%机械性刺激缩足反应阈值(50%PWMT, g)和大鼠热刺激缩足潜伏期(PWTL)的变化。模型制备前,5组大鼠50%PWMT和PWTL基础值差异无统计学意义(P>0.05)；与假手术Sham组比较,造模后的SNL组、TN组和TS组在模型之后3～7 d 50% PWMT减少(P<0.01), PWTL缩短(P<0.01)；正常组C组50%PWMT和PWTL差异无统计学意义。术后7d开始鞘内给药后,与神经病理性疼痛模型SNL组比较,鞘内注射Tat-LK15-nNOS siRNA的TS组在10～14 d50%PWMT增加(P<0.01),PWTL延长(P<0.01)；而鞘内注射Tat-LK15-NCsiRNA的TN组50%PWMT (P>0.05), PWTL (P>0.05)差异无统计学意义。Tat-LK15-nNOS siRNA复合物对神经病理性痛大鼠脊髓背角nNOS表达的影响。与假手术Sham组比较,制备模型后SNL组脊髓背角nNOS mRNA及其蛋白表达上调(P<0.01),正常大鼠C组脊髓背角nNOS mRNA及其蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。鞘内给药后,与神经病理性疼痛组SNL组比较,鞘内注射Tat-LK15-nNOS siRNA的TS组大鼠脊髓背角nNOS mRNA及其蛋白表达显著降低(P<0.01)；而鞘内注射Tat-LK15-NCsiRNA的TN组大鼠脊髓背角nNOSmRNA及其蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论1.离体条件下,细胞穿透肽Tat-LK15可以成功介导siRNA转染多种细胞,Tat-LK15与siRNA质量比2：1为最佳交联比,具有良好的转染效率。细胞毒性极低,安全优势突出。细胞穿透肽Tat-LK15可成功介导nNOS siRNA转染RGC-5神经细胞并干扰nNOS的过度表达,所以Tat-LK15可以作为运载siRNA干扰神经细胞nNOS表达的有效工具。并且Tat-LK15可高效介导nNOS siRNA转染原代大鼠脊髓背角神经元细胞。2.SNL神经病理性疼痛大鼠50%机械性刺激缩足反应阈值(50%PWMT,g)和大鼠热刺激缩足潜伏期(PWTL)均明显降低；鞘内注射Tat-LK15-nNOS siRNA复合物,可显著抑制SNL神经病理性疼痛大鼠的50%机械性刺激缩足反应阈值(50%PWMT, g)和大鼠热刺激缩足潜伏期(PWTL)的降低；神经病理性疼痛大鼠脊髓背角nNOS mRNA水平及蛋白水平的表达显著升高；鞘内注射Tat-LK15 nNOS/siRNA复合物,可明显抑制神经病理性疼痛大鼠脊髓背角nNOS mRNA水平及蛋白水平的升高。3.上述结果表明：在体条件下细胞穿透肽Tat-LK15可成功介导nNOS siRNA干扰神经病理性疼痛大鼠脊髓背角nNOS的过度表达。从而缓解神经病理性疼痛大鼠的痛觉过敏,对神经病理性疼痛具有治疗作用。