【摘 要】
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荧光杂交探针以其良好的生物相容性、易于合成和修饰等优点,被广泛应用于临床诊断、食品安全及环境检测等领域。但现有的荧光杂交探针大多存在着灵敏度低、操作复杂、反应速
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荧光杂交探针以其良好的生物相容性、易于合成和修饰等优点,被广泛应用于临床诊断、食品安全及环境检测等领域。但现有的荧光杂交探针大多存在着灵敏度低、操作复杂、反应速度缓慢、需要酶促放大等问题,限制了其在实际样品中的应用,为此本论文设计并合成了一种微米级荧光杂交探针,分析了此探针的应用潜能,并实现了其对microRNA(miR)的检测。具体内容如下:1.制备了一种微米级DNA荧光杂交探针(μSDat)。以环状DNA为模板,在phi29DNA聚合酶诱导下发生滚环扩增反应(RCA)合成长链sDP1,随后以sDP1为模板经链置换扩增反应(SDA)合成了sDP2,纯化后的sDP2与带FAM修饰的DNA进行自组装后合成探针。2.考察了μSDat探针的特性。sDP2可与带FAM修饰的DNA正确杂交,使得此探针自身带有强荧光。此探针长度约13.5±3.2μm,包含两个区域,3’端的一个靶结合区域,5’端的约1000个荧光报告区域。3.基于μSDat探针构建了一种纸芯片器件,通过简单的步骤即可实现miR21的超微量检测。将5’端带生物素标记的探针(bDCP)与微米级荧光杂交探针打印到纸上,靶分子miR21与两个探针均能发生碱基互补配对,形成bDCP/miR21/μSDat双链体,从而在纸基上产生强荧光来实现miR21的超微量检测。该反应迅速灵敏,并且具有良好的选择性。30 min内即可实现miR21的快速检测,其检测限可达到0.1 pM。此外,该纸芯片可以用于各细胞系中内源性成熟miR21含量的测定,其结果与qRT-PCR相当。本研究首次合成了微米尺度的荧光杂交探针,结合纸芯片器件实现了miR的超微量检测。该方法有望在化学、生物学、医学诊断及生物传感领域广泛应用。
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