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缺血性脑血管病是常见的中枢神经系统疾病之一,具有很高的致死率和致残率。与心脏病、恶性肿瘤一起,构成了多数国家的三大致残疾病,严重威胁着人类的健康。如何改善缺血性脑损伤后脑血流、促进受损神经元的修复与再生,一直是人们研究的重点和难点,神经生长因子和血管生长因子更是倍受关注。目前研究较多的是胰岛素样生长因子-1(Insulin like growth factor-1,IGF-1)、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)和碱性成纤维生长因子(Basic fibroblast growth factor, bFGF)等。随着研究的不断深入,外源性IGF-1已开始应用于缺血性脑血管病的实验研究,但脑缺血后IGF-1和VEGF、bFGF表达的关系,以及IGF-1发挥神经营养保护作用的确切机制,目前为止,尚不清楚。目的:通过线栓法建立大鼠大脑中动脉栓塞后局灶性脑缺血再灌注模型。经侧脑室注射胰岛素样生长因子(IGF-1)后,采用免疫组化和RT-PCR技术,观察IGF-1对大鼠脑组织中血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维生长因子(bFGF)蛋白和基因表达的影响,初步探讨IGF-1对脑缺血损伤发挥神经保护作用的分子机制,为IGF-1进一步临床应用提供理论依据,为脑梗死的治疗提供新途径。方法:1、采用线栓法制备大鼠大脑中动脉栓塞后局灶性脑缺血再灌注模型。2、动物分组:取健康成年SD大鼠72只,体重250~300g,雌雄不限,随机分为3组:(1)假手术组(n =24);(2)脑缺血/再灌注组(n =24); (3) IGF-1治疗组(n =24)。脑缺血/再灌注组、IGF-1治疗组再随机分为缺血2h再灌注12 h、1d、3d、7d四个亚组,每亚组6只。假手术组也按相同的时间点随机分为四个亚组,每亚组6只。IGF-1治疗组大鼠局灶性脑缺血/再灌注(MCAO)模型制备成功后,即刻在立体定向仪下向大鼠左侧脑室缓慢注射IGF-1 10μL,时间不少于10min;脑缺血/再灌注组用同样方法注射0.01M磷酸盐缓冲液(PBS)10μL;假手术组仅作颈部皮肤切口和血管分离,不行MCAO,但行等量PBS注射。3、各组大鼠均在规定的时间内快速断头取脑。从额极到枕叶按A、B、C、D 4等份切脑,A脑片弃去,在规定的时间内剥取B、C脑片梗死灶周围的脑皮层组织各100mg,在1 %的DEPC水中稍作漂洗,立即放入冻存管中,液氮中保存。B脑片用于检测VEGF- mRNA含量、C脑片用于检测bFGF-mRNA含量,均采用RT-PCR方法。D脑片放入4%多聚甲醛中固定,24h后石蜡包埋,作5μm切片,用于HE染色和VEGF、bFGF的免疫组化染色。4、行为学评价:在缺血再灌注后12h、24h、3d、7d,由不了解实验分组的人员采用改良神经功能评分(Modified neurological severity score, mNSS)对动物进行行为学检查。改良神经功能评分从0到18分之间分级(正常为0分,最严重损伤18分)。1分代表不能完成一项任务或缺少一项测试反射,1~6分为轻度损害,7~12分为中度损害,13~18分为重度损害。5、统计学分析:所测数据均用均数±标准差( x±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析, SNK-q检验;两组间比较采用t检验。以a=0.05作为显著性检验水准。结果:1、脑缺血/再灌注组和IGF-1治疗组大鼠术后出现左侧Horner’s征,右侧肢体瘫痪,以前肢为重,说明MCAO模型制备成功。假手术组仅出现左侧Horner’s征。2、假手术组大鼠均无神经功能缺损症状。大鼠缺血再灌注12h、24h、3d、7d行为学评分(mNSS),IGF-1治疗组均显著低于缺血再灌注组((P<0.05)。3、脑缺血/再灌注组半暗带皮质区VEGF蛋白阳性细胞数于脑缺血再灌注24h达高峰,3d降至较低水平,7d降至基线水平。IGF-1治疗组VEGF蛋白表达于缺血再灌注12h到7d较脑缺血/再灌注组显著增高,p<0.05。4、VEGF mRNA表达以12h表达最高,持续至24h很快降低,7d降至较低水平。IGF-1治疗组VEGF mRNA表达,在各时间点均高于脑缺血/再灌注组,p<0.05。5、脑缺血/再灌注组bFGF蛋白阳性细胞数于24h达高峰,然后逐渐降低,7d仍有少量表达;IGF-1治疗组各时间点bFGF蛋白表达均较脑缺血/再灌注组高,P<0.05。6、bFGF mRNA 12h表达水平最高,后逐渐降低,7d降到较低水平。IGF-1治疗组与脑缺血/再灌注组比较,各时间点bFGF mRNA表达均较同时间点高,P<0.05,有统计学意义。7、HE染色,光镜下观察,假手术组脑组织结构无明显异常。缺血再灌注24 h正常神经细胞数减少明显,神经元空泡变性多,可见细胞核固缩,组织疏松,细胞间隙增大。IGF-1治疗组脑组织损伤程度较轻,皮层神经元细胞空泡变性较少,间质水肿轻,正常细胞数增多。结论:1、本实验通过侧脑室注入外源性IGF-1,明显改善了大鼠脑缺血再灌注后的神经功能,证明IGF-1对缺血再灌注损伤有保护作用。2、脑缺血后可诱导VEGF、bFGF基因及蛋白表达增高,是自我保护机制的一种反应。3、IGF-1可以使脑缺血再灌注后脑组织中VEGF、bFGF的表达进一步增高。4、IGF-1对脑缺血的保护作用可能是通过增加脑组织中VEGF、bFGF基因及蛋白表达而实现的。5、本实验探讨了IGF-1对脑缺血的保护作用及可能机制,为临床应用IGF-1治疗脑缺血损伤提供了理论依据。