论文部分内容阅读
肝癌是危害人类的重大疾病之一,而且与很多肿瘤一样,肝癌术后的复发转移也是导致肝癌死亡率居高不下的主要原因,因此,研究肝癌转移的机理并寻找有价值的预警标志物,成为进一步提高肝癌临床治疗水平的关键。BRMS1基因(Breast Cancer Metastasis Suppressor 1)是2000年在乳腺癌细胞中发现的肿瘤转移抑制基因,之后的研究发现,它能够抑制包括乳腺癌和黑色素瘤在内的多种肿瘤的转移,由此引发了人们对BRMS1基因是否为抑制肿瘤转移过程中重要的共有基因的思考。近年来的研究表明,在人类乳腺癌和黑色素瘤细胞株中与mSin3a·HDAC复合物(mSin3组蛋白去乙酰化复合物)相互作用,通过表观遗传学的方式抑制NF-κB的活性,进而抑制一些肿瘤转移促进基因或者抗凋亡基因的表达,发挥促进凋亡抗肿瘤转移的作用。但是,对于BRMS1基因在肝癌发生及转移中的作用目前还没有相应的研究。因此,本课题拟从遗传学角度着手,基于BRMS1同样能够在肝癌细胞模型中通过促进凋亡抑制肿瘤转移的假设,观察BRMS1与肝癌细胞转移的相关性,以期对肝癌细胞的转移以及BRMS1基因在肝癌转移中的分子机制进行探究。作为之后深入研究的前期工作,本设计首先研究BRMS1在多种肝细胞中的表达。Western blot的结果显示在SK-HEP-1细胞中检测到差异剪接体2的表达,Hep G2细胞仅检测到差异剪接体1,而L-02和Hep 3B细胞两种差异剪接体都表达,而且在表达差异剪接体1的3株细胞中,Hep 3B细胞差异剪接体1的表达量较高,另两个较低。实时定量PCR对BRMS1基因差异剪接体1的表达进一步检测,发现SK-HEP-1细胞的表达水平最低,Hep 3B最高,L-02和Hep G2介于两者之间。随后以Hep G2细胞的mRNA为模板,扩增人的BRMS1基因差异剪接体1,构建pEGFP-BRMS1质粒,在SK-HEP-1细胞株进行过表达,并用AnnexinV-PE和7-AAD双染的流式细胞术研究BRMS1对SK-HEP-1细胞凋亡的影响,结果显示:pEGFP-BRMS1转染组两种染料双阳性,即处于凋亡后期的细胞数目,显著高于pEGFP-N2对照组;用PI单染检测存活率,发现:pEGFP-BRMS1转染组与pEGFP-N2对照组相比存活率显著降低。上述实验结果表明,BRMS1基因的过表达能够促进SK-HEP-1细胞的凋亡,抑制细胞生存,从而为BRMS1基因抑制肝癌转移机制的阐明提供思路。