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基因在时间(发育时期)和空间(组织、细胞)维度的精确表达是哺乳动物胚胎正常发育的先决条件和重要保障。因此,基因表达调控研究是了解哺乳动物早期胚胎发育的重要途径之一。目前,该方面的研究主要集中于转录水平上转录调控因子(转录因子、转录辅助因子)及表观调控因子等对基因表达的影响,及其在早期胚胎发育过程中的功能和作用机制。作为另一层次调控基因表达的重要方式,可变剪接(Alternative splicing,AS),包括可变启动子的使用(Alternative promoter usage,AP usage)极大地丰富了基因转录和编码产物种类和功能的多样性和复杂性,但是它们在哺乳动物早期胚胎发育中的模式和功能研究则相对滞后。 本研究首先以小鼠原肠作用之后的E7.5天胚胎三胚层作为研究材料,在全转录组水平分析了可变剪接在小鼠早期胚胎发育中的存在模式和潜在功能。研究发现,小鼠E7.5天胚胎三胚层之间普遍存在差异的可变剪接事件;产生差异可变剪接事件的基因参与转录与翻译调控、表观遗传修饰、原肠作用、Mapk和Wnt信号通路等多种发育相关生物学过程和信号途径。进一步研究发现,在438个已知和可能的RNA剪接因子中,有39个剪接因子在三胚层之间呈现整体转录水平的差异表达,73个剪接因子在三胚层之间发生可变剪接水平的差异变化,其中包括一些已知的重要RNA剪接因子,如ESRP1、ESRP2、MBNL2、CELF4、GRSF1和RBFOX2等。这可能是三胚层中普遍存在差异可变剪接现象的原因之一,以及各胚层特异剪接模式建立的基础。值得注意的是,哺乳动物中不常见的可变启动子现象在所有发生显著性差异变化的可变剪接事件中所占比例极高,超过总变化事件的四分之一(430/1648),仅次于哺乳动物中最常见的外显子跳跃事件(616/1648)。三胚层之间发生可变启动子显著性差异变化的基因广泛参与细胞增殖、迁移,神经管、心血管发育,TGFβ信号通路等原肠作用前后相关的生物学过程,并且可能参与调控各胚层特异性的发育事件。另外,这些基因中包含了很多在小鼠早期胚胎发育过程,包括原肠作用中发挥重要功能的调控因子,如Tjp2、Pitx2、Net1、Pdgfra、Ash2l、Uhrf1、Ldha、Sept9、Hnrnpl、Ubtf和Ube2i等。上述结果提示可变剪接,尤其是可变启动子的使用可能作为一种重要的机制参与调控哺乳动物早期胚胎发育。 为了进一步研究可变启动子在小鼠早期胚胎发育中的功能和作用机制,以Ash2l,所有产生可变启动子事件的基因中差异最显著的基因为例,通过体内和体外实验解析了可变启动子对于Ash2l基因发挥功能的影响。Ash2l属于trithorax基因家族的一员,其编码的ASH2L蛋白是Set1/MLL组蛋白甲基转移酶的核心组分之一,通过H3K4me3修饰发挥转录调控作用。已有的研究表明,Ash2l对小鼠早期胚胎发育和ES细胞多能性维持是必需的;另外,Ash2l通过可变启动子的使用在RNA水平分别产生Ash2l-1和Ash2l-2两种亚型,并由此产生ASH2L-1(623aa)和ASH2L-2(534aa)两种蛋白质,ASH2L-1在N端比ASH2L-2多89个氨基酸。但是,关于Ash2l的生理功能和作用机制还有诸多问题尚不清楚,其两种亚型在哺乳动物早期胚胎发育中是否具有不同的功能也有待进一步阐明。我们的研究发现,Ash2l通过可变启动子产生的两种亚型在小鼠发育过程中呈现时空特异性的表达模式。Ash2l-1在所有的组织细胞中组成型表达;Ash2l-2在卵母细胞和卵裂期胚胎中痕量表达,到桑椹胚阶段表达量上升,达到与Ash2l-1相当的水平;有意思的是在囊胚阶段出现一个表达高峰,表达量约为Ash2l-1的2倍;着床后,Ash2l-2表达迅速降低,到原肠作用前后只在内胚层少量表达,而在成年组织中只在特定的组织,如睾丸中表达。这种特定的表达模式暗示可变启动子驱动Ash2l基因表达的两种亚型可能具有时空特异性的功能。为了验证这个猜想,利用CRISPR/Cas9系统建立了亚型特异性敲除的小鼠模型。结果显示,特异性敲除Ash2l-1导致小鼠于妊娠中期(E9.5-E10.5天)死亡,并伴随轴旁中胚层发育异常;特异性敲除Ash2l-2没有明显的表型,这可能是由于Ash2l-1的补偿作用导致的,因为在ASH2L-2缺失时ASH2L-1表达量补偿性上调。而同时敲除两种亚型的小鼠胚胎在囊胚向卵柱期胚胎转变的过程中(E4.5-E5.5)死亡。另外,体外实验证明,Ash2l-1敲除的小鼠胚胎干细胞没有明显的异常,而Ash2l-2缺失导致小鼠胚胎干细胞凋亡增加,因而生存能力下降。这些结果说明Ash2l-1和Ash2l-2可能以不同的方式调控小鼠早期胚胎发育,同时也说明可变启动子通过作用于特定的基因,产生时空特异性表达和发挥功能的不同亚型,进而灵活并精确地调控哺乳动物早期胚胎发育。 本研究在全转录水平分析并揭示了可变剪接,尤其是可变启动子在小鼠早期胚胎发育中潜在的生物学意义。通过分析小鼠中可变启动子驱动的Ash2l两种不同亚型的功能,阐释了可变启动子对于基因以时空特异性方式调控小鼠早期胚胎发育的重要性,为研究和了解哺乳动物早期胚胎发育调控机制提供了新的思路和认识。