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实验目的 系统性红斑狼疮(SLE)是典型多基因遗传的自身免疫性疾病，发病率较高，多发于年轻女性，其重要特征是T和B淋巴细胞对自身核抗原耐受性丧失，产生多种抗核抗原成分抗体，形成免疫复合物沉积于不同组织并引起炎症。遗传、环境、免疫、激素等多种因素参与自身抗体产生及SLE发病，其中遗传因素起重要作用。 随着单基因病遗传连锁分析的巨大成功，以及人类基因组计划实施以后对基因分析方法的推动，复杂疾病致病基因的克隆成为当代遗传学研究的重点。通过特征表型进行疾病易感基因染色体定位，对揭示疾病成因有重要意义。自身抗体是自身免疫病的重要标志，抗核抗体为引起狼疮细胞形成的主要抗体，也是SLE最早被检测的自身抗体之一，一般在确诊SLE两年前患者血清中已出现抗dsDNA抗体，抗染色质抗体则出现更早。SLE患者和狼疮鼠模型自身免疫反应的发作都以自身抗核抗体的早期出现为特征，因此抗核抗体的产生对SLE发病起着决定性的作用。狼疮鼠可自发出现抗核抗体，在无菌环境亦然，提示外来因素对自身抗核抗体的影响不大；SLE病人的健康一级亲属也有自身抗核抗体的出现，同卵双生子血清抗体一致率高达92％，说明先天遗传因素是其发生的主要原因。 以人为对象进行遗传连锁分析研究，难度较大，重复性差。狼疮鼠在遗传定位研究方面有不可比拟的优势。应用微卫星遗传标记结合数量性状位点分析，可以对复杂疾病进行精确的易感基因染色体定位。本课题以(NZB×NZW)F1×NZB和(NZB×NZW)F1×NZW回交小鼠为研究对象，对来源于NZW和NZB小鼠的系统性红斑狼疮自身抗核抗体易感基因进行微卫星DNA遗传标记QTL分析，确定小鼠的IgG型抗染色质自身抗体、抗DNA自身抗体和抗组蛋白自身抗体的易感基因的染色体精确定位，为人类同源基因的克隆和鉴定奠定基础，并为进一步阐明SLE及其它自身免疫病的发病机理，以及开发新的可靠的治疗方法提供理论依据。实验方法 1，以酶联免疫吸附分析法检测8月龄新西兰狠疮鼠NZB、NZW、NZB/WFI血清中IgG、I娜型抗DNA抗体和抗染色质、组蛋白抗体滴度，比较NZB、NZW、NZB/W FI各种抗体水平。 2.繁育回交小鼠，筛选NZB和NzW间具有长度多态性的微卫星DNA遗传标记，染色体两端遗传标记距两端距离<10 cM(里摩)，遗传标记之间距离<20。M，最终选出覆盖除性染色体外的全部19条染色体的共约200个多态性微卫星DNA遗传标记。 3.基因分型:提取鼠尾DNA，用覆盖小鼠全部基因组的近200个微卫星DNA遗传标记进行PCR一SSLP(PCR一Single Se卿enee玩n纳Polymor-phism)分析，根据分离片段大小确定每只小鼠的每个微卫星DNA遗传标记位点的基因型。 4.回交小鼠血清抗体水平分析:以酶联免疫吸附分析法(EUSA)测定8月龄回交小鼠IgG、IgM型抗染色质抗体、抗DNA抗体、抗组蛋白抗体值。 5 .QTL分析:将每只小鼠的每个微卫星DNA遗传标记位点的基因型和抗体值输人MAPMAKE形QTL和MAPMANAGE甲QTL分析软件数据库中，进行基因组扫描，确定狼疮鼠抗染色质抗体、抗DNA抗体、抗组蛋白抗体易感基因的染色体定位。增加基因组扫描峰值附近的微卫星DNA遗传标记数量，以获取更精确的易感基因染色体定位。 6.根据QTL分析结果，利用互联网查阅基因组数据库，筛选候选基因，为进一步定性和克隆这些基因打好基础。实验结果 一、sLE模型新西兰小鼠I步、坛M型抗核抗体水平分析 1.8月龄NzB小鼠I醛型抗dsDNA抗体及I娇型抗ssDNA抗体平均滴度较低。NZW鼠比NZB略高，但无明显差异。与亲代NzB及NzW相比，(NZB x NZW)Fl子代小鼠I多型抗dsDNA抗体及抗ssDNA抗体滴度明显升高，与亲代差异非常显著(P<0.001)。 2.8月龄NZB小鼠IgM型抗dsDNA抗体及IgM型抗ssDNA抗体平均滴度较高，与NZW差异显著(P<0 .01)。(NZB x NzW)Fl子代I娜型抗山DNA及抗ssDNA抗体滴度比NZW增高且差异显著(P<0.01)，比NZB则降低。 3·8月龄NzB、NZW小鼠I步型抗染色质抗体及I步型抗组蛋白抗体平均滴度较低。与亲代NZB及NZW相比，(NZB x NZW)Fl子代小鼠I步型抗染色质及组蛋白抗体滴度明显增高，与亲代差异非常显著(P<0 .05)。 4·8月龄NZB小鼠IgM型抗染色质抗体及IgM型抗组蛋白抗体平均滴度较高，与NzW差异显著(P<0.05)。(NZB x NZW)FI子代IgM型抗染色质及抗组蛋白抗体滴度比NZW增高且差异显著(P<0 .05)，比NZB则降低。 二、SLE模型新西兰小鼠抗DNA抗体易感基因染色体定位的研究 1.QTL分析确定(NZB xNZW)Fl xNZW回交鼠I步型自身抗dsDNA、ssDNA抗体遗传易感基因的定位:I药型自身抗dsDNA抗体及ssDNA抗体的易感基因位于小鼠第17染色体近中心端，与微卫星DNA遗传标记D17MIT61、D17MIT22、TNFa、D17Mrr168有较强连锁，玩ds值均>5。这是小鼠H一2复合体包括TNFa的基因区域。 候选的易感基因位点来源的确定:通过比较回交小鼠在易感基因D17MI竹2 B/W、W/W型之间的血清自身抗dsDNA抗体水平的平均值，经t一检验结果显示，B/W型>W/W型，P值<0.001，说明易感基因来源于NzB;比较翎FaB/W、W/W型之间的血清自身抗dsDNA抗体水平的平均值，