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一、研究背景类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）是一种慢性炎症性自身免疫病,滑膜炎和骨侵蚀是主要的两大病理特征,其中滑膜炎是骨侵蚀最重要的诱因。RA滑膜组织通过分泌大量炎症因子及上调核因子κB受体活化因子配体（RANKL）的表达,趋化破骨前体细胞至关节,同时促进破骨细胞（OC）的形成和活化。因此控制滑膜炎可很大程度预防骨侵蚀,但需要注意的是OC才是RA骨侵蚀必不可少的细胞,单纯控制滑膜炎很难逆转骨侵蚀。并且新的观点认为骨破坏不再是不可逆的RA终末期病变,而是一种活动性的病理改变且在RA病程早期就可以出现。因此值得思考的是RA滑膜炎和骨丢失是否存在共同的分子机制?Rho A属于Rho小GTP蛋白酶家族,其下游效应分子为ROCK。Rho A/ROCK主要参与非经典Wnt/PCP通路的信号转导,同时可与MAPK、NF-κB等多个信号途径相偶联。而Wnt/PCP通路不仅参与OC的分化过程,而且在RA滑膜增殖、炎症、侵袭过程中发挥重要作用。既往关于Rho A/ROCK的研究主要局限在肿瘤性疾病,而针对RA患者及炎症性关节炎动物模型的相关研究尚少。因此本课题同时研究Rho A/ROCK在体外对RA-FLS生物学表型和鼠OC分化的影响及分子机制,并且通过体内实验探讨Rho A/ROCK对小鼠CIA模型的影响。该研究为同时改善滑膜炎和修复骨侵蚀提供理论依据,为新的RA靶向药物的开发奠定基础。二、研究目的第一部分:明确Rho A、ROCK2在RA滑膜组织及滑膜细胞中的表达情况。第二部分:明确Rho A在体外对RA-FLS增殖、凋亡、细胞周期、迁移和侵袭、MMPs和炎症因子分泌的影响。第三部分:明确Rho A在体外对（骨髓单核细胞）BMMC融合及OC分化的影响。第四部分:明确Rho A对CIA小鼠关节症状、滑膜病理、软骨侵蚀、软骨下骨骨小梁结构、OC形成及炎症因子分泌的影响。第五部分:明确Rho A在RA-FLS及OC中作用的分子机制。三、研究方法第一部分:1.收集RA、创伤患者膝关节滑膜进行FLS原代提取并鉴定;2.HE染色比较两组滑膜病理改变;3.IF及IHC比较Rho A在两组滑膜中的表达;4.WB比较Rho A、ROCK2在两组滑膜中的表达;5.IF共染及WB比较Rho A、ROCK2在两组FLS中的表达。第二部分:1.构建人源过表达/干扰Rho A慢病毒并转染RA-FLS,采用嘌呤霉素筛选稳转株;2.q PCR、WB确定转染效果;3.CCK8法比较Rho A过表达/干扰稳转株的细胞活性,流式细胞仪检测细胞周期的改变;4.Tunel法检测凋亡细胞比例,WB检测凋亡相关蛋白;5.划痕和Transwell实验比较细胞迁移、侵袭能力,WB检测MMPs的表达;6、q PCR检测细胞TNF-α、IL-1β、IL-17、IL-21 m RNA的表达。第三部分:1.q PCR比较Rho A对RA-FLS中OPG/RANKL比值的影响;2.提取小鼠BMMC并培养;3.q PCR检测RANKL+M-CSF诱导BMMC分化过程中Rho A m RNA的表达;4.构建鼠源过表达/干扰Rho A慢病毒并转染小鼠BMMC;5.q PCR确定转染效果;6.TRAP染色比较Rho A对OC分化的影响;7.Dil细胞膜染色比较Rho A对BMMC膜融合的影响。第四部分:1.建立小鼠CIA模型,IHC检测Rho A、ROCK2在CIA小鼠关节滑膜的表达;2.小鼠膝关节注射鼠源Rho A慢病毒,IHC检测EGFP的表达验证转染效果,WB检测小鼠关节Rho A的表达;3.观察Rho A对CIA小鼠关节的炎症指数的影响;4.取小鼠膝关节,HE染色观察Rho A对膝关节病理表现的影响;5.番红O-固绿染色观察Rho A对膝关节软骨侵蚀的影响,WB及IHC检测小鼠膝关节MMP3、MMP9、MMP13的表达;6.Tunel荧光染色检测Rho A对CIA小鼠膝关节滑膜凋亡的影响;7.通过Micro-CT三维重建显示Rho A对CIA小鼠软骨下骨微结构的影响;8.TRAP染色观察膝关节滑膜与骨骼连接部位OC前体细胞及OC的形成;9.眼球取血,ELISA检测Rho A对CIA小鼠血清IL-17、IL-21的影响。第五部分:1.q PCR检测RA-FLS中JAK/STAT、MAPK和NF-B等信号通路相关分子m RNA;2.WB进一步验证RA-FLS中相关信号分子的表达;3.q PCR检测RANKL介导OC分化中通路分子m RNA的表达;4.通过CO-IP研究Rho A、ROCK2、p STAT3之间的相互作用。四、研究结果第一部分:1.成功提取FLS,免疫荧光鉴定表现为Vimentin阳性、CD68阴性;2.HE染色提示RA滑膜明显增生伴大量炎性细胞浸润;3.免疫荧光、免疫组化及免疫印迹法均提示Rho A在RA滑膜高表达,但ROCK2差异表达不明显;4.免疫荧光共染提示Rho A和ROCK2在RA-FLS高表达,免疫印迹法提示Rho A在RA-FLS高表达,ROCK2表达升高但差异不明显。第二部分:1.摸索出Lv-Rho A、Lv-ctr、Sh-Rho A、Sh-ctr慢病毒适宜MOI值,RA-FLS转染效率约80%;2.q PCR及WB验证Rho A的表达被相应的上调及下调;3.Lv-Rho A转染细胞的活性高于Lv-ctr组,且处于S期的细胞比例明显增多,从而发挥促进RA-FLS增殖的作用;Sh-Rho A转染细胞的活性明显低于Sh-ctr组,细胞阻滞于G0/1期,进而抑制RA-FLS的增殖;4.Lv-Rho A组细胞凋亡比例较Lv-ctr组明显降低,凋亡相关蛋白caspase-9、-3的表达亦减少;Sh-Rho A组细胞凋亡比例明显高于Sh-ctr组,caspase-9、-3的表达增加;5.Lv-Rho A促进RA-FLS的迁移和侵袭,以及促进MMP3、13的表达;Sh-Rho A明显抑制RA-FLS迁移和侵袭的能力,并且抑制MMP3、13的表达;6.Lv-Rho A促进RA-FLS表达IL-1β、IL-17、IL-21m RNA,Sh-Rho A仅抑制RA-FLS表达IL-17 m RNA。第三部分:1.Lv-Rho A下调RA-FLS中OPG/RANKL的比值,Sh-Rho A则明显上调该比值;2.成功分离出BMMC,诱导BMMC向OC分化过程中Rho A在Day3的表达较Day0明显升高,Rho A在Day5的表达和Day3比较无差异;3.摸索出适宜于BMMC的MOI值,q PCR检测提示Rho A的表达被相应的改变;4.TRAP染色提示Lv-Rho A促进OC的形成,与此同时Sh-Rho A抑制BMMC分化为OC;5.Dil细胞膜染色提示Lv-Rho A可以促进BMMC膜的融合,而Sh-Rho A明显抑制RANKL诱导的BMMC膜融合。第四部分:1.CIA小鼠关节滑膜Rho A、ROCK2的表达均较正常小鼠明显升高;2.IHC提示携带EGFP的慢病毒已在小鼠膝关节稳定表达,同时WB验证Lv-Rho A上调了小鼠膝关节Rho A的表达,而Sh-Rho A可明显下调Rho A的表达;3.Lv-Rho A组的小鼠关节评分在初次免疫后第43天开始显著高于Lv-ctr组,而Sh-Rho A组的评分在第47天开始明显低于Sh-ctr组。4.HE染色提示Lv-Rho A可明显加重CIA小鼠膝关节病理改变,而Sh-Rho A组病理评分相对Sh-ctr组下降;5.番红O-固绿染色结果提示Lv-Rho A组和Lv-ctr组相比膝关节软骨侵蚀加重,而Sh-Rho A组软骨侵蚀程度较Sh-ctr减轻;WB及IHC检测结果提示Lv-Rho A可促进小鼠膝关节表达MMP3、MMP9和MMP13,而Sh-Rho A可明显抑制MMPs的表达;6.Tunel染色提示Lv-Rho A抑制CIA膝关节滑膜细胞的凋亡,而Sh-Rho A具有明显促凋亡效果;7.Micro-CT结果提示Lv-Rho A组软骨下骨结构破坏明显,骨小梁稀疏变薄,骨体积分数（BV/TV）明显降低;而Sh-Rho A组软骨下骨结构完好,骨小梁排列规则且致密,BV/TV较明显升高;8.TRAP染色结果提示Lv-Rho A组的滑膜OC前体细胞及OC的数量明显高于Lv-ctr组,而Sh-Rho A组和Sh-ctr组比较OC前体细胞及OC的形成明显被抑制;9.Lv-Rho A可明显升高CIA小鼠血清IL-17、IL-21的水平;而Sh-Rho A可抑制IL-17、IL-21的分泌。第五部分:1.Lv-Rho A明显上调RA-FLS中ROCK2、JAK2、STAT3 m RNA的表达,Sh-Rho A抑制ROCK2、JAK2、STAT3 m RNA的表达;2.WB结果提示Lv-Rho A组GTP-Rho A、ROCK2、p STAT3的表达明显高于Lv-ctr组,Sh-Rho A组相对于Sh-ctr组GTP-Rho A、ROCK2、p STAT3的表达被明显下调;3.q PCR结果显示在RANKL诱导Lv-Rho A组OC分化的过程中,第3天ROCK2、c-Fos、NFATc1 m RNA的表达以及第5天NFATc1 m RNA的表达明显高于Lv-ctr组;相应的Sh-Rho A在第3天下调ROCK2、c-Fos的表达,在第3、5天同时下调NFATc1的表达;4.Rho A在RA-FLS中通过与ROCK2结合传导信号,而ROCK2可以直接作用于p STAT3。五、研究结论以上研究结果表明,Rho A在RA患者及CIA小鼠的滑膜及FLS中表达明显升高,并且在体外干预Rho A的表达可以明显抑制RA-FLS的增殖、侵袭和炎症因子的分泌。Rho A通过促进BMMC膜的融合直接诱导OC分化,同时也可以下调RA-FLS中OPG/RANKL比值间接促进OC形成。体内实验结果与体外相一致,Rho A可明显促进CIA小鼠滑膜增生、软骨破坏以及骨侵蚀。进一步的机制研究提示,在RA-FLS中Rho A通过ROCK2传递信号,并且可以和JAK2/STAT3通路相偶联。而在小鼠OC分化过程中,Rho A亦通过ROCK2调控c-Fos、NFATc1的表达进而促进BMMC的融合及OC的形成。