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背景:在正常生理条件下,角膜自身可维持促血管生成因子与抗血管因子的动态平衡,角膜在光学上透明,无血管。多种角膜损伤可诱导形成角膜新生血管（corneal neovascularization,CNV）,如自身免疫病、感染、创伤、角膜移植排斥、先天无虹膜、炎症、肿瘤和缺血等。CNV可降低角膜透明度、导致视力受损、角膜水肿,甚至失明,据估计每年有140万人出现CNV,其中12%因此视力丧失。治疗方面,虽然有研究显示抗VEGF药物,类固醇激素,非甾体抗炎药,免疫抑制剂,均有一定疗效,但疗效均差强人意,临床依然欠缺有效治疗药物。索拉非尼（Sorafenib,SRB）是一种多靶点口服治疗肿瘤的药物,可同时作用于肿瘤细胞和血管。SRB具有双重抗肿瘤作用:通过阻断RAF/MEK/ERK系统传递细胞信号的途径,可直接阻碍肿瘤细胞的增殖,通过抑制血管器官细胞（VEGFR）和血小板（PDGF）的生长来阻断新血管的形成,从而可间接抑制肿瘤细胞的生长。既往研究显示,SRB对CNV有效,其主要作用于VEGFR/VEGFR通路。SRB属VEGFR的小分子酪氨酸酶抑制剂,有望成为治疗CNV的有效药物。目的:制备索拉非尼纳米脂质载体（SRB-NLCs）滴眼液,提高SRB角膜穿透性,增加其眼部局部浓度。对SRB-NLCs滴眼液处方进行优化,并对其表征、评价体外释放特征、稳定性、体外细胞毒性及眼内刺激性。在动物实验中评价SRB-NLCs滴眼液单次给后的眼部药代动力学特征及其在小鼠角膜碱烧伤模型中的抗CNV疗效,为探索创新性CNV治疗药物提供依据。方法:1、SRB-NLCs滴眼液处方优化及评价筛选SRB-NLCs处方,确定制剂辅料选择;采用差示扫描量热法（DSC）确定固体与液态脂质的比例;采用伪三元相图确定表面活性剂/助表面活性剂（Km）及混合脂质比例;以Km、脂质用量及药/脂比作为自变量,以药物含量及粒径作为因变量,采用星点设计-效应面法（CCD-RSM）优化SRB-NLCs处方;对获得的SRB-NLCs采用马尔文激光粒度仪（Zeta-sizer）测定SRB-NLCs的粒径分布、多分散指数（PDI）及Zeta电位、采用透射电子显微镜（TEM）、采用DSC等进行表征;采用动态透析袋溶出法,以0.25%吐温80-人工泪液为释放介质,进行SRB-NLCs体外释放动力学研究,以pH、PDI、粒径、药物含量及包封率为评价指标来考察SRB-NLCs滴眼液的不同贮存条件（4℃,25℃）的稳定性。2、SRB-NLCs滴眼液体外细胞毒性及兔眼刺激性SRB-NLCs滴眼液对人角膜上皮细胞的细胞（HCECs）毒性采用CCK-8试剂进行评价。采用自身对照法进行新西兰大白兔眼部刺激性试验。单次给予右眼和左眼结膜囊内0.1 mL0.05%SRB-NLCs滴眼液和同剂量生理盐水,设置时间点1 h、2 h、4h、24h、48h、72 h观察兔眼刺激性反应,根据兔眼Draize刺激性试验的评分标准进行评分,评价SRB-NLCs滴眼液的兔眼刺激性。3、SRB-NLCs滴眼液兔眼药代动力学特征建立并确认体内HPLC测量SRB浓度的方法学。将42只新西兰大白兔随机分为两组,每组21只。分别给予SRB-NLCs滴眼液和索拉非尼混悬液（SRB-Susps）,分别于0.083、0.5、1、2、4、8、12 h,取泪液、房水,角膜及结膜,药物提取后,采用HPLC测定SRB浓度。4、SRB-NLCs滴眼液抗CNV评价采用碱灼伤法建立小鼠角膜新生血管模型。随机将小鼠分为5组,分别为阴性对照组（生理盐水组）、低浓度给药实验组、中浓度给药实验组、高浓度给药实验组、阳性对照组（0.025%磷酸钠地塞米松滴眼液）。采用Image J软件计算角膜新生血管面积;采用HE染色评价角膜组织病理状态;采用酶联免疫法（ELISA）检测VEGF-A、PDGF-AB蛋白因子的表达;综合评价药物在小鼠眼中的抗CNV疗效。5、统计学方法所有实验数据均采用SPSS统计软件（21.0版）进行统计学分析,用均数±标准差（X±SD）表示。采用方差分析的多组比较。采用Fisher’sleast significant difference（LSD）检验比较各组间差异,采用独立样本t检验分析比较SRB-NLCs和SRB-Susps在体眼药代动力学研究。药动学参数采用DAS 2.0药动学软件处理。结果:1、SRB-NLCs滴眼液处方优化及评价根据溶解度结果选择单月桂酸甘油酯作为固体脂质、Capryol-90作为液态脂质、Transcutol?P作为助表面活性剂。采用DSC筛选出合适的固液脂质比例为2:1。通过聚氧乙烯（40）氢化蓖麻油（CRH 40）和15-羟基硬脂酸聚乙二醇酯（HS 15）的乳化能力比较,选择CRH 40为表面活性剂。确定Km的范围为3-7,混合脂质的用量范围为0.2-1.0g。通过CCD-RSM确定合适处方为:Km为3,混合脂质为0.5 g,药/脂比为0.02。制备的SRB-NLCs呈圆球形,平均粒径为（111.87±0.93）nm,PDI为（0.15±0.01）,平均电位为（-0.35±0.08）mV,滴眼液pH为（5.67±0.14）,渗透压为（296.89±2.54）mOsm/kg,包封率为（99.20±0.86）%,载药量为（1.98±0.02）%。SRB-NLCs的体外释放呈缓释特征,其体外释放动力学符合Korsmeyer-Peppas方程。稳定性实验考察结果表明SRB-NLCs滴眼液在25℃时相对稳定。2、SRB-NLCs滴眼液体外细胞毒性及兔眼刺激性体外细胞毒性实验结果表明,SRB-NLCs药物浓度在50 μg/mL作用2 h后,SRB-NLCs会对HCECs产生毒性作用,HCECs活力低于80%。在更高浓度250μg/mL下,SRB-NLCs实验组的HCECs活力小于60%,0.25 h后表现出明显的毒性。由此可见SRB的细胞毒性取决于其浓度。兔眼的刺激性实验表明SRB-NLCs滴眼液对兔眼无刺激性。3、SRB-NLCs滴眼液兔眼药代动力学特征本研究建立的体内HPLC测定SRB浓度的方法学专属性良好,准确性、精密度良好,日内、日间精密度的相对标准偏差（RSD）均＜15%,回收率在85%～115%范围内。该方法学可用于测定SRB在泪液、角膜及结膜中浓度,各组分分离良好,对保留时间无干扰。SRB-NLCs和SRB-Susps组在泪液、角膜及结膜中的Tmax均为0.083 h。与SRB-Susps组相比,SRB-NLCs在泪液、角膜及结膜Cmax分别是SRB-Susps的1.90倍、3.90 倍和 2.34 倍;AUC0-12h分别是SRB-Susps的 1.90 倍、6.79 倍和 1.23 倍;SRB包载于NLCs内能够提高药物在眼部组织中的浓度,促进眼部的生物利用度。4、SRB-NLCs滴眼液抗小鼠角膜碱烧伤模型CNV评价在小鼠眼抗CNV的治疗中,与阴性对照组相比,实验组的CNV发展较迟、生长缓慢、新生血管长度较短、新生血管面积小。组织病理学试验显示,实验组的CNV均比对照组少。ELISA实验结果表明,碱烧伤后第3、7 d,实验组VEGF-A和PDGF-AB表达比阴性对照组低。结论:本研究制备的SRB-NLCs滴眼液,可促进SRB角膜穿透性,增加其生物利用度,具有良好的稳定性,体外释放呈缓释特征,兔眼安全耐受性良好,小鼠角膜碱烧伤模型中抗CNV效果良好。SRB-NLCs滴眼液是一种安全、有效治疗CNV的新途径,有望成为SRB的新型眼部药物递送系统。