一、研究背景和目的：　　 肠出血性大肠埃希菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)O157:H7是一种食源性人畜共患肠道病原微生物,可导致食物中毒,引起人和动物严重的腹泻、出血性肠炎(haemorrhagic colitis,HC)、溶血性尿毒综合症(Haemolyticuraemic syndrome,HUS)、血栓性血小板减少性紫癜(thromboticthromobocytopenic porpura,TTP)等。1983年,Riley等首次报道了美国密执安州和俄勒冈州发生肠出血性大肠埃希菌O157:H7引起的严重食源性疾病一出血性结肠炎。此后,由EHEC O157:H7引起的散发病例和小型暴发在世界范围内不断发生。1986年,我国首次从出血性结肠炎患者中分离到EHEC O157:H7。目前,已有十余个省份从市售食品、进口食品、家畜家禽、腹泻患者粪便中分离到该菌。目前,在世界各地,肠出血性大肠埃希菌O157:H7暴发与流行仍时有发生,发病呈上升趋势,对社会公共卫生和人类健康构成极大威胁。　　 EHEC O157:H7的毒力因子主要有紧密黏附素(Intimin)、分泌蛋白、志贺毒素Ⅰ型、Ⅱ型(Shiga toxin,StxⅠ、StxⅡ)和溶血素(Haemolysin,Hly)等,肠出血性大肠埃希菌O157:H7的致病作用主要通过产生志贺样毒素(STX1和STX2)和细菌对肠黏膜上皮细胞黏附-抹去损伤(attaching and effacing lesion,A/E损伤)完成。　　 EHEC O157:H7导致肠上皮细胞特异性A/E损伤的相关致病蛋白主要位于染色体上的肠细胞脱落位点(Locus of enterocyte effacement,LEE)致病岛内。LEE毒力岛大小35-43kb,由LEE1(ler,escRSTU)、LEE2(escCJ,sepZ,cesD)、LEE3(escVN)、LEE4(espABD、espF)和LEE5(tir,eae,cesT)等5个操纵子组成[16],包含41个开放读码框,分别编码外膜黏附素(adhesin)、紧密素(intimin)、Ⅲ型分泌系统(TTSS)、转位蛋白(EspA,EspB,EspD)、效应蛋白(Tir,EspG,EspF,Map,EspH)、伴侣分子(CesAB,CesD,CesD2,CesF,CesT)和调控子(Ler,GrlA,GrlR)等,还有一些功能未知蛋白。　　 目前,EHEC O157:H7感染致病的效应蛋白已增加到20多种,其中效应蛋白EspF的作用范围最大。EspF与线粒体和核仁结合、与细胞内N-WASP(neuronal　　 Wiskott-Aldrich syndrome)、SNX9(sorting nexin9)、Abcf2、CK18、SGLT-1、NHE3等蛋白分子结合,导致上皮细胞紧密连接破坏、微绒毛消失、肠上皮细胞骨架重排、肌动蛋白聚集、垫状结构(pedestal)形成,最后细胞凋亡,在EHECO157:H7感染导致的A/E损伤中起主要作用。　　 近几年,不同实验室对EspF蛋白在细胞特异性A/E损伤中的作用进行了一定程度的研究,尽管证实EspF可以突破肠上皮屏障,破坏肠屏障功能,参与破坏肠上皮细胞紧密连接,但EspF蛋白诱导宿主细胞死亡的机制仍然不甚清楚。同时,从目前发表文献来看,研究结果大多来自EPEC。虽然EHEC和EPEC均含有LEE4,同源性98％,但其基因编码的分泌蛋白的差异却达34％,两者破坏肠上皮细胞紧密连接导致肠屏障功能丧失的动力学机制也不一样。EPEC特异性黏附宿主小肠上皮细胞,而EHEC特异性黏附宿主大肠上皮细胞。　　 EHEC和EPEC对宿主细胞的致病性和分子机理却是不同的,那么,在EHECO157:H7中,EspF蛋白是否具有破坏肠屏障功能,影响肠上皮细胞紧密连接,诱导细胞死亡?是否也具有与宿主细胞线粒体结合导致宿主细胞死亡?EHECO157:H7侵袭黏附宿主上皮细胞后是否导致小肠粘膜层改变或脱落而导致细胞黏附-抹去损伤?EspF蛋白怎样启动了细胞线粒体死亡途径?EspF蛋白哪个功能域在起作用?EspF是否在细菌致病过程中是否还有其他作用呢?这方面的问题和分子基础还不十分清楚,国内外未见报道。　　 本论文拟揭示EspF蛋白在EHEC O157:H7导致肠上皮细胞产生黏附-抹去损伤中的作用,阐明EHEC导致细胞黏附-抹去损伤的分子机制,对深入探讨EHEC O157:H7感染与致病的分子机制、开发药物、最终有效控制其暴发流行,具有重要的科学意义和应用价值。　　 二、研究方法：　　 1.构建espF基因缺失突变菌株EHEC O157:H7(ΔespF)　　 采用生物信息学方法,分析肠出血性大肠埃希菌O157:H7毒力岛LEE4上的espF基因结构,确定espF基因N末端编码线粒体靶向信号区MTS的一段核苷酸序列作为拟缺失对象。采用重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlapextension PCR,简称SOE PCR)将espF基因N末端核苷酸序列缺失,克隆到自杀质粒pCVD442,构建重组自杀性载体pCVD442:ΔespF,转化到感受态细胞E coli SM10中,构建重组菌株SM10(pCVD442:ΔespF),重组自杀性载体结合转移,抗性筛选和鉴定EHEC O157:H7(pCVD442:ΔespF),与EHEC O157:H7同源重组,敲出细菌染色体上的espF基因,筛选和PCR鉴定EHEC O157:H7espF基因缺失突变菌株。　　 2.野生株和突变株与Lovo细胞的黏附　　 EHEC O157:H7野生株和突变株分别作用结肠癌细胞Lovo细胞不同时间后,经吉姆萨染色液染色或固定,在光学显微镜和电子显微镜下,观察野生株和突变株与Lovo细胞的黏附情况。　　 3.乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性检测　　 将EHEC O157:H7野生株和突变株加入结肠癌Lovo细胞培养,分别在培养2b、4h和6h时收集上清,通过酶标仪检测各个时段上清中的LDH值(波长为490 nm),并按公式计算LDH释放率。　　 4.EspF蛋白与线粒体结合并导致细胞凋亡的研究　　 用Rho123荧光染料染色Lovo细胞线粒体,溴乙啶染色EHEC的细胞质和细胞核,野生EHEC O157:H7、EHEC O157:H7 espF基因缺失菌株和阴性对照株分别感染Lovo细胞,不同时间段内共聚焦激光显微镜下观察EspF蛋白是否与线粒体结合；激活Caspase家族蛋白酶-9,-3的活性,启动细胞线粒体死亡途径,将细胞裂解后,SDS-PAGE分离,用细胞色素C抗体免疫印迹检测细胞色素C。通过这些研究,研究EspF蛋白能否迁移到宿主肠上皮细胞,并与线粒体结合,EspF蛋白能否启动宿主细胞死亡途径,导致细胞凋亡。　　 5.EHEC espF基因缺失菌株感染小鼠　　 用野生EHEC O157:H7、EHEC O157:H7 espF基因缺失菌株和阴性对照株分别灌胃感染小鼠,饲养20-30天,观察小鼠生长情况和病死率,处死小鼠后观察比较等段结肠形态和肠炎、水肿等病理特征,研究黏附小肠细菌的重量、数量,显微镜下观察小肠粘膜层厚度或其他组织病变程度等。　　 6.EHEC O157:H7 Intimin B细胞抗原表位的预测根据从GenBank上查到的EHEC O157:H7标准株EDL933 Intimin的氨基酸序列(Acession number:CAA77642),选其C末端300个氨基酸为目的片断；采用DNASTAR软件分析IntC300的亲水性、β-转角、柔韧性、表面可及性和抗原指数；预测IntC300的B细胞抗原趋势；综合各种参数分析的结果,预测出一组EHEC O157:H7 IntiminB细胞抗原表位多肽。　　 7.Intimin B细胞抗原表位的免疫学研究合成一条EHEC O157:H7Intimin B细胞抗原表位多肽KASITEIKADKT,将抗原多肽与KLH偶联。将6～8周龄的SPF级BALB/c小鼠60只,随机分为4组:皮下免疫组,皮下免疫对照组,鼻腔免疫组,鼻腔免疫对照组,每组15只。将偶联产物与弗氏完全佐剂混合后通过皮下和鼻腔两种途径免疫小鼠,对照组用PBS免疫,每间隔两周加强免疫一次,2、3次免疫后7天每组随机抽10只小鼠从眼眶采集血清,间接ELISA法检测小鼠血清抗体效价。末次免疫10天后以EHEC O157:H7活菌进行免疫动物的攻毒保护实验,小鼠于攻毒前禁食、禁水12 h,每只小鼠经食道灌注1×1010 CFU/ml EHEC O157:H7活菌0.3 ml。攻毒后12 h恢复饮食饮水,并记录动物死亡情况。　　 三、结果：　　 1.筛选和鉴定出了EHEC O157:H7 espF基因缺失突变菌株　　 本实验获得了espF缺陷同源性片段ΔespF,大小为1762 bp。经测序比对,全长747 bp的espF基因中间缺失了162 bp。缺失的位置位于EHEC O157:H7全基因组中的4659104-4659265,EspF蛋白N端的第15-68个氨基酸。构建了重组质粒pMD19T-ΔespF和重组自杀性质粒pCVD442-ΔespF,筛选与鉴定同源重组的EHEC O157:H7(ΔespF)。　　 2.野生株比突变株更易黏附于结肠癌细胞Lovo细胞　　 通过光学显微镜和电子显微镜观察,野生株作用于Lovo细胞2 h后,细胞膜模糊,细胞膜表面聚集大量的细菌。而突变株作用于Lovo细胞2 h后,可见细胞形态完整,细胞膜边缘较清晰,膜上见有较少细菌黏附,未见细胞膜有明显损伤。　　 3.EHEC O157:H7野生株的毒性高于espF基因缺失突变株　　 酶标仪测定各个时段上清中的LDH值后,计算LDH释放率,野生株的LDH释放率显著高于突变株；细菌作用后6 h的细胞LDH释放率高于2 h和4 h两组,4 h后细胞LDH的释放率高于2 h的；不同时间点各菌株的LDH释放率存在显著差异,野生株6 h组LDH释放率均值最高,阴性对照2 h组LDH释放率均值最低。攻毒实验结果显示,WT组小鼠死亡3只,小鼠存活率为70％,低于ΔespF组小鼠存活率(P<0.05),说明espF基因突变后,细菌毒力有所下降。　　 4.突变株导致小鼠结肠黏附抹去损伤程度比较野生株有所减轻　　 野生组、突变组和对照组小鼠经相应细菌感染后,接种了EHEC WT菌株的小鼠肠道发生轻度水肿,固化粪便较少,是细菌引起的小肠结肠炎的典型表现；接种了AespF菌株的小鼠肠道较健康,并带有固化粪便。用小鼠抗EHECO157:H7抗体进行免疫荧光染色观察,WT组的绿色荧光较ΔespF组绿色荧光多。　　 5.野生株感染小鼠导致结肠上皮细胞凋亡程度高于突变株　　 采用TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒检测结肠黏膜上皮细胞凋亡情况,WT组小鼠结肠切片发现明显绿色荧光,结肠上皮细胞出现凋亡；而AespF组小鼠结肠绿色荧光比WT组较少,其细胞凋亡情况轻于WT组。LB液体组小鼠结肠切片未发现明显的绿色荧光,说明结肠细胞无凋亡情况。　　 6.综合预测了5段EHEC O157:H7 Intimin B细胞抗原表位　　 综合各种参数,预测了肠出血性大肠埃希菌O157:H7 Intimin的658-669、711-723、824-833、897-914、919-931等5个肽段可以作为B细胞抗原表位。根据文献综合分析,我们选择EHEC O157:H7 IntC300的658-669肽段序列KASITEIKADKT作为EHEC O157:H7的抗原位点进行下一步实验。　　 7.658-669肽段抗原表位的合成及免疫保护作用的研究　　 合成的多肽与KLH偶联后通过皮下和鼻腔两种途径免疫小鼠,结果显示两种途径免疫小鼠所获血清均能检测到高滴度的IgG抗体,皮下免疫的血清滴度达到6400,鼻腔免疫为1600。鼻腔免疫获得的IgA抗体滴度(3200)明显高于皮下免疫(100)。皮下免疫组攻毒后存活率较低,鼻腔免疫小鼠可以引起小鼠产生保护性免疫应答,Intimin的658-669多肽是具有应用前景的EHEC O157:H7多肽疫苗的候选抗原。　　 四、结论：　　 本论文：　　 1.成功构建了肠出血性大肠埃希菌O157:H7 espF基因缺失突变株。　　 2.细胞感染和动物实验表明,野生株的毒性明显高于突变株,野生株与结肠癌细胞Lovo细胞黏附率小于突变株。　　 3.突变株导致小鼠结肠黏附抹去损伤程度比较野生株有所减轻。　　 4.预测了EHEC O157:H7 Intimin一段序列为KASITEIKADKTB的细胞抗原表位。　　 5.合成多肽免疫后,发现鼻腔免疫获得的IgA抗体滴度明显高于皮下免疫。鼻腔免疫小鼠可以引起小鼠产生保护性免疫应答,Intimin的658-669多肽是具有应用前景的EHEC O157:H7多肽疫苗的候选抗原。　　 本论文为进一步揭示EspF蛋白在EHEC O157:H7导致肠上皮细胞产生黏附一抹去损伤中的作用,对深入探讨EHEC O157:H7感染与致病的分子机制、开发药物、最终有效控制其暴发流行,具有重要的科学意义和应用价值。