研究背景随着中国进入老年化社会,一些老年疾病发生率也随之上升。我国心肌梗死患者数量呈现逐年上升趋势。根据WHO统计心血管事件是全球的头号死亡原因。急性心肌梗死占各类心血管事件的40%以上,虽然临床上有溶栓药物、介入治疗及冠状动脉搭桥术的应用及使心肌梗死范围减小,最大限度的保护受损心肌细胞,但是心肌梗死后心肌细胞修复非常缓慢,使得已经损失的心肌很难恢复。在过去30年中,心肌梗死发生后直接的死亡率(发生后30日内)降低到了10%,但一年内的死亡率依然约为50%不变。血流再灌注引起的炎症细胞浸润,自由基的产生及心肌的异常性重构,使心肌梗死后心脏出现一系列继发性病理性改变如：坏死心壁向外膨出、心脏破裂、心率失常、瘢痕愈合、心力衰竭等,影响心梗后患者的生活质量。由于成人的心肌细胞的再生能力差,心肌梗死使受损的心脏组织失去心肌细胞和形成纤维疤痕组织会妨碍心肌的正常同步收缩,加重心脏健康部位的负荷,造成更多的心肌细胞死亡和心壁变形,将会严重影响心脏的功能。心肌梗死的高发病率,高死亡率和高复发仍然困扰着我们。为了解决这些问题,有人提出了在心脏组织内注射新生的心肌细胞或者干细胞以替换和修复受损的心脏组织。其主要方法是在心肌坏死部位直接用注射器注射细胞以达到修复的效果,但是用此类方法会使注入的细胞不能固定于受损部位,容易渗入血流或者心室腔内随血流分布于身体其他部位,并且心肌梗死后造成的局部缺血并不利于通过注射移植的细胞生存,这将严重影响此类治疗方式的治疗效果。组织工程心肌补片(ECP)应用于心肌梗死后的细胞修复是一种很有前景的治疗方式,心肌补片主要是将细胞结合于组织工程支架上以促进利用细胞治疗心肌梗死的效率。组织工程支架能够模仿天然心肌的结构并具有心功能,诱导心肌细胞附着和生长,促进在体外的心肌功能化,并且可以修复体内梗死部位的心肌恢复心功能,理想的心肌补片应该具有如下这些特性：1、支架材料具有良好的弹性、可延展性、稳定性、可塑性和有一定的机械强度,不会因心肌细胞的跳动损坏支架。2、具有良好的生物相容性,在体内不引起炎症反应、毒性反应和免疫排斥反应,当心肌补片移植到动物模型体内,不会因心脏高速和高强度的跳动而脱离心肌梗死部位。3、心肌补片具有同步收缩的能力和良好的导电性能进行生物电传导并避免移植体内后发生严重的心律失常。目前火多数心肌补片仅能解决上面提到的一到两个特性。天然聚合物(明胶,海藻酸钠,I型胶原和纤维蛋白)作为心脏修补具有良好的生物相容性,但是其弹性较弱,压缩后不易回复原有形状。大孔壳聚糖-明胶冷冻凝胶具有良好的弹性特性,但其导电性能微弱。为了解决细胞能够紧密黏附于支架材料上且在心肌细胞剧烈跳动的情况下心肌细胞能够带动组织工程支架材料的运动。我们模仿贻贝利用贻贝足蛋白紧密黏附于礁石上使贻贝不易被海浪吹走设计了仿贻贝导电冷冻水凝胶。研究表明将贻贝足蛋白破坏后能在其中找到左旋多巴,贻贝正是利用氧化的多巴和末氧化的多巴交联,形成高分子网状聚合物黏附于礁石上。目前利用贻贝足蛋开发的生物粘合剂具有广阔的前景,不仅用作手术缝合中的医用胶粘剂,并且贻贝足蛋白还具有促进细胞贴壁和增殖的功能利于伤口愈合及恢复。与其他医学修复材料和药物相比,贻贝足蛋白由于来源于生物与其特殊的分子结构,具有很好的生物相容性和可降解性,是一类极具优势和潜力的生物粘合剂。我们利用贻贝足蛋白提取的多巴胺以亚甲基双丙烯酰胺(MBA)作为交联剂结合到带有双键的明胶上,制成带有多巴胺的纳米纤维,将极大的促进细胞黏附。冷冻水凝胶是在零度一下的温度合成的,其中反应主要在液态／半冰冻阶段经过聚合反应形成交联网络,在低温环境下水由液态变为固态形成冰晶。这些冰晶在解冻后能使水凝胶产牛相瓦链接的网络结构。过去也有其他方法用于制作大孔水凝胶如气体发泡,纤维粘接,微滴乳状液的形成,相分离,冷冻干燥,和致孔剂浸出。冷冻水凝胶的特点是其具有高度互联的大孔网络结构能够增强水凝胶的机械性能。我们利用明胶作为支架合成的冷冻水凝胶,但单纯的明胶合成的冷冻水凝胶在压力下容易破碎且弹性较小,并不能满足作为心肌补片的条件。我们在其中加入明胶-甲基丙烯酸酯和聚(乙二醇)二丙烯酸酯(PEGDA),其经常被用来提高水凝胶的机械性能。聚吡咯(PPY)是一种常见的导电材料,是一种黑色,无毒的高分子聚合物在空气中稳定性好。常用于组织工程心肌材料中其电导率可达102-103S/cm。在冷冻水凝胶内加入分散的聚吡咯纳米颗粒与合成的多巴胺纳米纤维,在低温下冷冻成胶合成具有良好的弹性与机械性能及优良的导电性,使心肌细胞在支架材料上能够带动支架同步收缩,能够满足作为心肌补片的条件。目的：1.构建符合心肌补片的组织工程支架材料并移植心肌细胞使其功能化,对体外构建的心肌补片进行形貌的表征与生物形容性等性质进行研究；2.体外构建的组织工程心肌补片进行心肌梗死SD大鼠体内验证;方法：1.心肌补片组织工程支架材料的合成与表征。分别合成多巴胺交联剂(DOPA-MBA)、带有双键的明胶(MA-G)、带双键明胶的聚吡咯(MA-G-ppy)预聚物。将预聚物按照不同的组合分别合成基于多巴胺的导电冷冻水凝胶(DOPA-based MA-G/PEGDA/Ppy cryogel).不含多巴胺的导电冷冻水凝胶(MA-G/PEGDA/Ppy cryogel)、基丁多巴胺的彳不导电冷冻水凝胶(DOPA-based MA-G/PEGDA cryogel)不含有多巴胺的不导电冷冻水凝胶(MA-G/PEGDA cryogel).利用核磁共振氢谱检测带有双键的明胶内双键比例,多功能数字式四探针测试仪测量样品的导电率,英斯特朗万能试验机检测冷冻凝胶的机械性能。2. 体外构建的心肌补片进行形貌的表征与生物形容性的检测。购入1-3日龄SD大鼠乳鼠,收集足量心肌细胞与心肌成纤维细胞分别接种于不同冷冻凝胶上。利用活／死细胞染色法与CCK-8检测不同冷冻水凝胶上培养相应时间细胞的细胞活力。用扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)观察接种有心肌细胞的冷冻水凝胶的超微结构。体外免疫荧光与Western blot检测心肌细胞间隙连接蛋白43(CX-43)与仪辅肌动蛋白(a-actinin)在DOPA-based MA-G/PEGDA/Ppy冷冻水凝胶与DOPA-based MA-G/PEGDA冷冻水凝胶支架材料上的表达。3.体外构建的组织工程心肌补片进行心肌梗死SD大鼠体内验证。雄性SD大鼠(250±20克)结扎左前降支使SD大鼠永久性心肌梗死。形成心肌梗死后14天,存活的大鼠接受超声心动图检查。选择FS<30%的SD大鼠进行实验,随机分为心肌梗死组和心肌梗死+心肌补片组。超声心动图检测在舒张期和收缩期左心事内部尺寸(分别为LVIDD和LVIDs),短轴缩短率(FS)和射血分数(EF)。将不同实验组SD大鼠处死后收集心脏并切片用马森三色染色测量左心室梗死区域与未梗死区域面积的百分比,免疫荧光进行a-actinin蛋白检测并追踪CM-Dil染色的心肌细胞。4.统计学分析以上实验均设有阴性对照实验,每次实验至少重复3次。统计分析采用SPSS13.0统计软件完成,结果用均数±标准差(Mean±SD)来表示。组间比较采用单囚素方差分析(One-way ANOVA),方差齐性的组间比较采用Tukey法,方差不齐的组问比较采用Dunnett’s T3法,p<0.05认为差异有统计学意义。结果：1.支架材料的表征。为了计算明胶的双键的百分比,我们使用吡咯作为标准,因为吡咯核磁共振氢谱峰不与明胶的峰值重叠。根据吡咯的峰和双键的峰的面积比,约40%的游离氨基是由MA携带在明胶上的。不同冷冻凝胶的机械性能是南应力-应变曲线和杨氏模量进行检测。带有多巴胺的导电冷冻水凝胶能200-500千帕的压力。其能够在压缩后立即回复原来的形状。我们的结果显示聚吡咯町以提高生物材料的机械强度。此外,我们的结果也证明了多巴胺交联剂能够调节冷冻水凝胶的刚度。聚吡咯和多巴胺在生物材料弹性和仿生杨氏模量上具有协同作用。扫描电镜结果显示,所有组的冷冻水凝胶均具有均匀的多孔结构。所有组的孔径均匀,分布良好。冷冻水凝胶的孔径大小与他们的刚度一致。最小孔径的冷冻水凝胶具有最高的杨氏模量。聚吡咯纳米颗粒均匀分布带有多巴胺的导电冷冻水凝胶表面。多巴-MBA作为交联剂能够将聚吡咯纳米颗粒固定在支架材料表面。2.带有多巴胺的导电冷冻水凝胶具有良好的心肌细胞黏附,伸展和细胞活力。不同组冷冻水凝胶上接种的心肌细胞在培养6小时和24小时后用活死检测试剂盒检测细胞在冷冻水凝胶上的存活情况,含有多巴胺的冷冻水凝胶在心肌细胞培养6小时后,心肌细胞已在水凝胶上伸展,而不含有多巴胺的冷冻水凝胶上的细胞仍然呈现为圆形未伸展状态。培养24小时后心肌细胞已开始在含有多巴胺的冷冻水凝胶上增殖,数量明显增多。利用CCK8试剂盒检测在水凝胶上培养3天,7天,14天,28天的心肌细胞活力,显示了心肌细胞活力在带有多巴胺的冷冻水凝胶组细胞活力随着培养天数的增加细胞活力不断增大,能够维持较高的细胞活力直到28天,而不带有多巴胺的冷冻水凝胶其细胞活力总是呈现在比较低的水平,在细胞培养14天后绌胞活力开始下降,并在28天后凝胶上的细胞数量已大大减少。3. DOPA-based MA-G/PEGDA/Ppy冷冻水凝胶体外实验表明其能使心肌细胞功能化。在体外培养心肌细胞于DOPA-based MA-G/PEGDA/Ppy冷冻水凝胶上,心肌细胞实现同步收缩,且带动支架材料一起跳动。通过免疫荧光与western blot发现CX43与a-actinin的表达均是在DOPA-based MA-G/PEGDA/Ppy冷冻水凝胶上培养的心肌细胞表达比DOPA/MA-G/PEGDA冷冻水凝胶多。将体外培养于冷冻水凝胶上的心肌细胞通过扫描电镜与透射电镜观察培养8天的心肌细胞,可见在DOPA-based MA-G/PEGDA/Ppy冷冻水凝胶上培养的心肌细胞表面黏附着一些细小颗粒,而DOPA/MA-G/PEGDA冷冻水凝胶上培养的心肌未见这些细小颗粒,我们猜测可能是Ppy黏附于心肌细胞表面,在支架材料上的心肌细胞膜表面有许多黑色的Ppy纳米颗粒,心肌细胞内部存在肌节。4.移植心肌补片于心肌梗死的SD大鼠能促进大鼠左心室功能的恢复。移植心肌补片至心肌梗死大鼠左心室在超声心动图上显示,其FS、EF相对未移植心肌补片的心肌梗死大鼠均有较大提高。将移植心肌补片的心肌梗死大鼠与未移植心肌补片的大鼠心脏切片进行马森三色染色,其中移植有心肌补片的大鼠其心梗范围缩小,心肌细胞移植进入心肌梗死部位对瘢痕组织进行修复。同样的将切片进行免疫荧光染色,可见在大鼠瘢痕组织内出现大量的心肌细胞,其在心肌补片上存在大量与支架材料结合的心肌细胞,而未移植心肌补片的大鼠其瘢痕组织内未见心肌细胞且心壁显得更加菲溥。结论：在本研究中,以多巴胺-MBA作为交联剂成功制备带有多巴胺的导电冷冻水凝胶。这种导电生物材料具有超弹性和良好的导电性。此外,该导电冷冻水凝胶与心肌细胞具有较强的亲和性和提高心肌细胞的功能化。凶此,贻贝启发导电冷冻水凝胶加载心肌细胞心肌补片植入到心肌梗死SD大鼠梗死部位,它显示供体细胞能够保留在心肌补片支架上并且迁移到心肌梗死的疤痕部位,梗死区域有新的心肌形成并提高心功能。因此,含有多巴胺的导电冷冻水凝胶是一类具有前景的心脏支架。