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糖尿病心肌病（Diabetic cardiomyopathy,DCM）是糖尿病慢性并发症中一类影响人群健康及生活质量较为严重的疾病,目前尚无针对糖尿病心肌病治疗的特效药,其防治是目前医学研究领域的重要课题。DCM的发病过程十分复杂,已有的研究表明心肌纤维化是其重要的表现及进展过程。硫化氢（Hydrogen sulfide,H2S）是已发现的第三种新型气体信号分子,研究证实它的生理和生物学功能对生物体存在重要作用,如防治动脉粥样硬化、控制血压、改善纤维化、镇痛、抗帕金森病等,其具体的作用机制可能与其对抗生物体内的内质网应激、氧化应激、细胞自噬、调控蛋白激酶C（Protein kinase C,PKC）信号通路、Janus激酶（Janus Kinase,JAK）信号通路中相关蛋白的表达有关。细胞自噬又称II型程序性细胞死亡,正常水平的自噬对调节细胞的损伤和老化有重要作用,但过度的自噬会引起细胞死亡。研究发现,在高血糖状态、心肌梗死、高血压、长期缺血缺氧等疾病时细胞自噬处于长期激活水平,它加速了细胞死亡以及疾病的发展。PI3K/AKT1信号通路被认为是细胞内最重要的生存通路,在自噬中发挥重要的调节作用,研究表明,抑制该信号通路可诱导巨噬细胞及肿瘤细胞的自噬。PKC可调节细胞的代谢、分化、增殖、凋亡以及癌变等,在糖尿病大鼠中PKC有诱导其心肌肥大、纤维化进而影响大鼠心功能的作用。热休克蛋白70（Heat shock protein 70,HSP70）在正常水平下是机体的一种保护性蛋白,但其过度表达时对机体起损害作用。JAK/STAT信号转导通路广泛存在于生物体的细胞和组织内,其涉及多种病理生理过程如细胞免疫、细胞增殖与分化、细胞凋亡、炎症反应、肿瘤等。大量研究证实,JAK/STAT信号转导通路参与多种疾病引起的组织器官纤维化模型的发生发展。研究证明,H2S可以抑制糖尿病（Diabetes mellitus,DM）模型大鼠的心肌纤维化。本研究利用链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）诱导DM大鼠模型,观察细胞自噬及PI3K/AKT通路、PKC/HSP70通路以及JAK/STAT通路在糖尿病大鼠心肌组织的表达,探讨硫化氢与这些通路的关系以及对糖尿病大鼠心肌纤维化的影响,进一步了解硫化氢对糖尿病大鼠心肌纤维化作用的可能分子机制。第一部分硫化氢改善糖尿病大鼠心肌纤维化目的:观察硫化氢对链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠心肌纤维化的影响。方法:40只成年雄性SD大鼠,随机分为4组（n=10）:正常对照组（Control组）;糖尿病模型组（STZ组）;硫化氢干预的糖尿病组（STZ+H2S组）;硫化氢干预的正常组（H2S组）。STZ组及STZ+H2S组大鼠按40 mg/kg剂量腹腔注射（Intraperitoneal injection,ip）STZ（柠檬酸钠缓冲液为溶剂）建立DM模型;Control组和H2S组仅腹腔注射以等剂量的生理盐水。在STZ注射72 h后,通过采尾静脉血测定大鼠空腹血糖,血糖浓度大于16.7 mmol/L时提示糖尿病大鼠造模成功。建模成功后STZ+H2S组和H2S组每天腹腔注射以磷酸缓冲盐溶液（Phosphate buffer saline,PBS）为溶剂的硫氢化钠（Sodium hydrosulfide,Na HS）溶液（100μmol/kg）作为H2S供体;Control组和STZ组每天注射等剂量的PBS溶液。实验进行8周后,处死大鼠,取大鼠心脏组织,苏木素-伊红染色（Hematoxylin Eosin,HE）及万吉森染色（Van Gieson,VG）观察大鼠心肌纤维病理形态学改变;Western blotting法检测各组心肌组织中I型、III型胶原蛋白、MMP-8、MMP-13、MMP-14、TIMP-1、TIMP-2蛋白表达水平。结果:HE染色结果显示:Control组大鼠心肌细胞排列整齐,细胞间隙正常,间质未见明显纤维化;与Control组相比,STZ组大鼠心肌细胞排列较紊乱,细胞间隙增宽,间质可见纤维化,而H2S组大鼠心肌细胞排列尚整齐,细胞间隙基本正常,间质有少许纤维化改变;与STZ组相比,STZ+H2S组大鼠心肌细胞排列较整齐,细胞间隙大致正常,间质可见少量纤维化。VG染色结果显示:Control组大鼠心肌纤维排列紧密整齐,心肌组织周围及肌间隙中仅有少量胶原沉积;与Control组相比,STZ组大鼠心肌纤维排列疏散紊乱,心肌组织血管周围胶原沉积明显增多,而H2S组大鼠心肌纤维排列紧密,心肌组织周围可见少许胶原沉积;与STZ组相比,STZ+H2S组大鼠心肌纤维排列整齐,心肌组织周围胶原沉积明显减少。Western blotting法结果显示:与Control组对比,STZ组大鼠心脏组织中I型及III型胶原蛋白、MMP-8、MMP-13、MMP-14、TIMP-1、TIMP-2蛋白表达水平均明显上调,H2S组上述蛋白表达改变无统计学意义;H2S干预后,上述改变得到明显改善。小结:硫化氢可改善链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠心肌纤维化。第二部分硫化氢改善糖尿病大鼠心肌细胞自噬及PI3K/AKT通路蛋白的表达目的:观察细胞自噬及PI3K/AKT通路在糖尿病大鼠心肌组织中的表达水平,探讨硫化氢对其的影响。方法:大鼠处死前的方法步骤同第一部分方法学。透射电镜（Transmission electron microscope,TEM）观察心肌组织中的自噬小体;Western blotting法检测各组大鼠心肌组织中Beclin-1、Atg3、Atg5、Atg16、PI3K、AKT1蛋白的表达。结果:透射电镜结果显示:在Control组、STZ+H2S组及H2S组大鼠心肌组织中均未见自噬小体,而STZ组大鼠心肌组织中可见自噬小体。Western blotting法结果显示:与Control组相比,STZ组大鼠心肌组织中Beclin-1、Atg3、Atg5以及Atg16蛋白的表达均显著增加,而PI3K及AKT1蛋白的表达水平明显下调,而H2S组大鼠心肌组织中上述蛋白的表达差异无统计学意义;H2S干预后,与STZ组对比,STZ+H2S组大鼠心脏组织中Beclin-1、Atg3、Atg5以及Atg16的表达水平均显著下降,而PI3K及AKT1的表达明显升高。小结:PI3K/AKT通路蛋白表达下降及细胞自噬水平的升高可能参与糖尿病大鼠心肌纤维化的调控机制,而硫化氢改善糖尿病大鼠心肌纤维化的机制可能与上调PI3K/AKT通路蛋白的表达及下调细胞自噬水平有关。第三部分硫化氢改善糖尿病大鼠心肌纤维化的其他机制研究目的:探讨硫化氢对糖尿病大鼠心肌纤维化影响的其他可能机制。方法:大鼠处死前的方法步骤同第一部分方法学。Western blotting法检测各组大鼠心肌组织中PKC、HSP70、JAK-1、STAT-1、STAT-3、STAT-5、STAT-6等蛋白的表达水平。结果:Western blotting法结果显示:与Control组对比,STZ组大鼠心肌组织中PKC、HSP70、JAK-1、STAT-1、STAT-3、STAT-5及STAT-6蛋白表达水平均明显升高,而H2S组大鼠中相应蛋白表达有差异但无统计学意义;而H2S干预后,与STZ组对比,STZ+H2S组大鼠心脏组织中上述蛋白表达水平均明显下降。小结:PKC/HSP70及JAK/STAT途径相关蛋白在糖尿病大鼠心肌组织中明显升高,其可能参与了糖尿病大鼠心肌纤维化的形成及进展;H2S改善糖尿病大鼠心肌纤维化的机制可能与调控PKC/HSP70信号通路及JAK/STAT信号通路有关。