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乳腺癌是女性常见恶性肿瘤之一,手术结合放化疗为主的综合治疗是其主要治疗方法。紫杉醇(paclitaxel,PTX),作为一种可作用于纺锤体微管结合进而导致有丝分裂阻滞及细胞死亡的强化疗药物,被广泛应用于复发及转移难治性乳腺癌的化疗。而获得性耐药则是限制其临床应用的一个主要方面,使得相当一部分患者并未从中受益。BubR1是一个重要的纺锤体检查点(Spindle assemble checkpoint,SAC)相关蛋白,在监浏细胞有丝分裂前中期向后期转化的过程中扮演重要角色。SAC的主要功能是通过监控染色体正确分离从而保持染色体数目的稳定性,在肿瘤发生发展中起着重要作用。本课题组前期实验发现,SAC相关蛋白很可能与特异作用于有丝分裂期的化疗药物紫杉醇的疗效有关。而有文献报道,某些BubR1 mRNA表达水平明显低于正常组织的肿瘤,更易于发生淋巴转移和复发。因此,我们推测BubR1在肿瘤细胞中的表达情况很可能与肿瘤对紫杉醇的反应性有一定的关系。本研究通过干扰BubR1基因表达,观察BubR1表达水平下调后紫杉醇对的乳腺癌细胞在细胞增殖,凋亡,迁移能力及染色体稳定性等方面的影响,探讨紫杉醇耐药新的可能机制。为临床筛选敏感个体和敏感药物,促进个体化化疗提供和寻求理论依据。目的:1.构建针对BubR1的复制缺陷型重组腺病毒。2.评价并证实BubR1复制缺陷型重组腺病毒(Ad-BubR1-siRNA)的干扰效果。方法:1.设计合成针对BubR1的siRNA序列,与载体PSES-Hus连接后电转E.coli-DH5α,测序鉴定穿梭质粒。穿梭质粒利用AdEasy系统进行同源重组,酶切鉴定重组质粒。重组质粒包装入Hek293细胞,10-14天后收获针对靶基因BubR1的复制缺陷型重组腺病毒Ad-BubR1-siRNA2. Ad-BubR1-siRNA感染实验目的细胞MCF-7后,应用Western Blot和定量RT-PCR检测BubR1蛋白和mRNA表达水平的变化,评价干扰效果。结果:1.成功构建针对靶基因BubR1的复制缺陷型重组腺病毒Ad-BubR1-siRNA.2.所构建的腺病毒中,Ad-BubR1-siRNA-2干扰效果最强。感染Ad-BubR1-siRNA-2后Hek293及MCF-7细胞中的BubR1内源性表达均受到明显抑制。结论:成功设计并构建针对靶基因BubR1的干扰腺病毒,在目的细胞中能有效抑制靶基因的表达,为下一步研究提供基础。目的:1.了解干扰检查点蛋白BubR1对乳腺癌细胞在紫杉醇作用下增殖及凋亡能力的影响。2.了解干扰检查点蛋白BubR1对乳腺癌细胞在紫杉醇作用下迁移能力的影响。3.了解干扰检查点蛋白BubR1对乳腺癌细胞在紫杉醇作用下染色体稳定性的影响。方法:1.cck8法制备细胞增殖曲线;Hochest法检测细胞凋亡率;平板克隆实验检测克隆生成率,共同评价BubR1受抑后乳腺癌细胞对紫杉醇的反应。2.细胞划痕法检测BubR1受抑后乳腺癌细胞在紫杉醇处理下迁移能力的变化。3.核型分析法检测BubR1受抑后乳腺癌细胞在紫杉醇处理下染色体不稳定性的变化。结果:1. cck8、Hochest、平板克隆实验共同提示干扰内源性BubR1表达后,乳腺癌细胞在紫杉醇处理下表现为增殖能力上升、凋亡能力下降、克隆生成率上升。而在无紫杉醇处理仅单独干扰BubR1的情况下组间无差异。2.细胞划痕实验提示干扰内源性BubR1表达后,乳腺癌细胞在紫杉醇处理下表现为迁移能力上升。而在无紫杉醇处理仅单独干扰BubR1的情况下组间无差异。3.核型分析实验提示干扰内源性BubR1表达后,乳腺癌细胞在紫杉醇处理下表现为染色体不稳定性上升,具有恶性变趋势。而在无紫杉醇处理仅单独干扰BubR1的情况下组间无差异。结论:成功干扰靶基因BubR1内源性表达后乳腺癌细胞在紫杉醇作用下表现为增殖能力上升、凋亡能力下降、克隆生成率上升、迁移能力上升及染色体不稳定性上升。而在无紫杉醇处理仅单独干扰BubR1的情况下,实验组与对照组无差异。提示BubR1水平在乳腺癌细胞发生获得性紫杉醇耐药的过程中发挥重要作用。