茶叶中抗Ⅱ型糖尿病功能多肽的分离鉴定

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糖尿病(Diabetes mellitus,DM)已经是世界上最常见的非传染性疾病之一。其中全球已被诊断的糖尿病成人患者中,90%是Ⅱ型糖尿病(Type2 Diabetes mellitus,T2D)。在中国T2D同样占了总病人的95%。由于治疗T2D常见药物具有一定的副作用,如低血糖,体重增加和胃肠道功能紊乱等,因此,寻找没有副作用,但相对低疗效的膳食疗法成为治疗糖尿病的替代疗法之一。富含茶多酚的茶叶(Camellia sinensis)一直是我国的传统健康功能性饮料,其作为一种天然降血糖材料已经被广泛研究。过去的研究多集中在抵抗T1D的研究,近来对T2D的研究相对较少,但增加趋势明显,在Ⅱ型糖尿病的膳食治疗中将发挥越来越多的作用。  1.茶叶提取物对以Ⅱ型糖尿病关键酶DPP-Ⅳ有明显的抑制效果。试验的几个茶样以正山小种提取物的抑制效果最好,其抑制率为76.40%±8.76%;绿茶龙井提取物的效果最差,仅为31.74%±5.35%。抑制效果的顺序为:红茶、黑茶>乌龙茶>黄茶、绿茶。  2.对不同茶叶提取物的内含物质(总茶多酚,总可溶性糖,总可溶性蛋白,8总儿茶素单体以及咖啡因)与其抗DPP-Ⅳ活性进行了相关分析。龙井的多酚总量(148.97±5.79mg/g)和EGCG含量(30.26±5.12mg/g)显著高于正山小种(5多酚1.66±2.36mg/g),EGCG0.21±0.09mg/g),EGC、C、咖啡因、EC和CG等的含量在不同茶提取物之间并没有显著性差异。试验茶样中,茶叶中多酚和EGCG)含量与其提取液对DPP-Ⅳ抑制率呈显著负相关(p<0.0110,p<0.0469)。  3.对红茶正山小种提取物的分级分离及效果验证,确认1kD以下多肽是红茶抗DPP-Ⅳ性的主要成分。通过SDS-PAGE对1kD以下多肽进行电泳分析,获得一个粗条带。利用UPLC-MS/MS对获得条带进行测序,共获得四条多肽(肽链Ⅰ-Ⅳ)。  4.茶多酚抑制DPP-Ⅳ的IC50为1010.63±31.92μmol/L,EGCG为338.722±44.09μmol/L,肽链Ⅰ为840.08±3.84μmol/L,肽链Ⅱ为326.25±1.08μmol/L,肽链Ⅲ为2810.40±2.68μmol/L,肽链Ⅳ为562.14±1.80μmol/L。结果显示肽链Ⅱ的效果最好,其次为EGCG,而肽链Ⅲ的效果最差。此外,肽链Ⅱ和EGCG对DPP-Ⅳ的抑制没有发现协同效应现象。  5.利用分子模拟的方法,对四条肽链(Ⅰ-Ⅳ)和儿茶素(C、EC、ECG、EGC、EGCG)与DPP-Ⅳ的结合位点进行预测。发现五种儿茶素可以在西格列汀的结合位点上与DPP-Ⅳ有效结合,属于柔性对接,其解离率依次为0.26%、0.38%、0.31%、0.54%、0.11%,以EGCG最佳。结合位点均在A链,主要的氨基酸活位点为Glu205,Glu206,Va1207,Phe208,Ser209,Arg669。肽链与DPP-Ⅳ的对接为刚性,与DPP-Ⅳ结合后会阻止其正常折叠从而起到抑制作用,它们的结合自由能按肽链Ⅰ-Ⅳ的顺序依次为-8.10 kCal/mol、-10.63 kCal/mol、-10.25 kCal/mol、-10.53kCal/mol,以肽链Ⅱ最佳。除了肽链Ⅲ其余的结合位点均位于B链。此外,EGCG与肽链Ⅱ进行对按时,发现其复合体有较高的稳定性,解离率仅仅为0.58%。肽链Ⅱ与EGCG结合成键的氨基酸主要为Phe3、Ala4、Asp7和Arg10。
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