【摘 要】
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适配体是从单链的DNA或RNA的随机文库中筛选出的一种新式的识别分子,单链随机寡核苷酸分子更容易形成多种三维空间立体结构,从而与自然界存在的不同分子作用,所以被广泛的应用于临床诊断等领域。适配体是通过SELEX技术筛选富集到的。该技术的基本思想就是在体外通过人工化学合成的方法合成一个单链寡核苷酸库,并与靶物质混合,通过各种方法将与靶物质结合的随机序列分离、富集,通过不断重复的筛选,把与靶物质有高亲
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适配体是从单链的DNA或RNA的随机文库中筛选出的一种新式的识别分子,单链随机寡核苷酸分子更容易形成多种三维空间立体结构,从而与自然界存在的不同分子作用,所以被广泛的应用于临床诊断等领域。适配体是通过SELEX技术筛选富集到的。该技术的基本思想就是在体外通过人工化学合成的方法合成一个单链寡核苷酸库,并与靶物质混合,通过各种方法将与靶物质结合的随机序列分离、富集,通过不断重复的筛选,把与靶物质有高亲和力的DNA或RNA从非常大的随机文库中分离出来。本课题的研究目标是建立一种新的DNA适配体筛选方法,创新地在SELEX中加入了DNA自裂酶,通过酶自我剪切的特性分离与富集可以和L-别异亮氨酸结合的适配体。本论文以枫糖尿症标志物L-别异亮氨酸为标靶分子,通过DNA自裂酶I-R3和II-R1构建随机文库,利用SELEX的方法对感应靶分子的适配体进行筛选,并完善基于自裂酶筛选小分子的实验方法。随机文库的设计是依据I-R3和II-R1发生剪切时的二级结构的特点,将随机序列插入到自裂酶的P2茎中,当随机文库中的序列与标靶分子L-别异亮氨酸结合时自裂酶的P2茎得到恢复,在含有Zn2+的中性缓冲溶液中发生自我剪切。实验通过对发生剪切的序列重复分离与筛选富集到能感应L-别异亮氨酸的适配体。对I-R3-Random随机文库进行了5轮筛选,富集到序列I-R3seq1。I-R3seq1在含有Zn2+的中性溶液中发生了自我剪切,而标靶分子的加入较为的明显提高了这条序列的剪切活性。通过SYBR Green I（SGI）方法对I-R3seq1结合L-别异亮氨酸的能力进行表征得到其KD值为549.7 n M。使用I-R3构建的文库每轮筛选需要进行多次PCR包括拆分单链DNA文库时使用的不对称PCR,而随着PCR次数的增多副产物也逐轮增加,给适配体的筛选增加了很大的难度。因此,我们对实验设计进行了改进:使用II-R1取代了I-R3进行了随机文库的构建。对II-R1-Random随机文库的筛选共进行了12轮。分别在第7轮、第9轮、第12轮都筛选到了两条相同的序列II-R1seq1和II-R1seq2,并且这两条序列表现出明显的富集趋势。通过对这两条序列的剪切验证发现它们都在在含有Zn2+的缓冲溶液（p H7.05）中发生了自我剪切,而L-别异亮氨酸的加入使剪切效率提高。其中II-R1seq1的剪切效率提高了约59.2%。通过SGI法对两条序列进行表征得到KD值分别为670.2 n M、1248.0 n M。实验设计的优化,不仅降低了多次PCR过程中副产物产生的可能性,同时还因为II-R1较弱的自我剪切活性从而降低了文库的背景剪切。本课题通过将DNA自裂酶引入SELEX的方法筛选出了能够感应L-别异亮氨酸的适配体为基于DNA自裂酶的SELEX筛选小分子提供了新的思路。
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