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目的围产期缺血缺氧是新生儿缺血缺氧性脑损伤(hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE)的主要病因。本研究主要目的是为了研究microRNA-27a(miR-27a)在大鼠海马神经元缺血缺氧过程中的作用,并初步探索其可能的作用机制。为新生儿缺血缺氧性脑损伤提供新的治疗方案和实验基础。方法(1)原代培养大鼠海马神经元,建立体外缺血缺氧细胞模型-氧糖剥夺模型(oxygen-glucose deprivation model),MTT(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide)分析法检测大鼠海马神经元在氧糖剥夺后细胞活力的变化。(2)实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)检测miR-27a在氧糖剥夺处理后海马神经元中和正常大鼠海马神经元中的表达差异。(3)采用在大鼠海马神经元中转染miR-27a mimic(模拟物)来过表达miR-27a,qRT-PCR检测转染后大鼠海马神经元中miR-27a的表达变化。(4)MTT分析法检测过表达miR-27a对氧糖剥夺后大鼠海马神经元活力的影响。(5)流式细胞仪和TUNEL分析法检测过表达miR-27a对氧糖剥夺后大鼠海马神经元细胞凋亡的影响。(6)在线软件(http://www.targetscan.org/)分析miR-27a可能调控的靶基因。(7)荧光素酶报告基因系统验证FOXO1(Forkhead box protein O1)是miR-27a调控靶基因。(8)Western blot检测miR-27a对海马神经元中FOXO1蛋白表达的影响。(9)构建FOXO1重组表达质粒(pcDNA3.1-FOXO1),并将重组质粒与miR-27a mimic同时转染海马神经元细胞,通过挽救实验进一步验证mi R-27a通过调控FOXO1发挥着OGD处理后保护海马神经元的细胞生物学作用。(10)Western blot分析mi R-27a对氧糖剥夺后海马神经元中凋亡相关蛋白(pro-caspase-3和cleaved caspase-3)的影响。结果(1)原代大鼠海马神经元成功培养,MTT分析结果显示:与正常对照组相比,氧糖剥夺处理6h后,海马神经元细胞活力明显下降(p<0.05),氧糖剥夺处理12h后,海马神经元细胞活力显著下降(p<0.01)。(2)qRT-PCR检测结果显示:与正常对照组相比,氧糖剥夺处理6h后,miR-27a的表达水平明显下降(p<0.05),氧糖剥夺处理12h后,miR-27a的表达水平显著下降(p<0.01)。(3)在海马神经元中转染miR-27a mimic 48h后,qRT-PCR检测结果显示:与正常对照组相比,miR-27a mimic转染组中miR-27a的表达显著增加(p<0.01)。(4)MTT分析法检测结果显示:与阴性对照组(mimic control)相比,miR-27a mimic转染组中海马神经元的细胞活力明显增加(p<0.05)。(5)流式细胞仪和TUNEL分析结果显示:与正常对照组相比,氧糖剥夺处理后的海马神经元细胞凋亡的比例显著增加(p<0.01);与阴性对照组(mimic control)相比,miR-27a mimic转染组中海马神经元的细胞凋亡比例显著降低(p<0.01)。(6)在线软件(http://www.targetscan.org/)分析FOXO1可能是miR-27a调控靶基因。(7)荧光素酶活性检测结果显示:在转染miR-27a mimic和包含FOXO13’UTR(野生型)荧光素酶质粒组的相对荧光素酶活性显著降低(p<0.01)。(8)Western blot检测结果显示:与未转染组和阴性转染对照组相比,miR-27a mimic转染组中FOXO1蛋白表达的显著下降(p<0.01)。(9)在海马神经元细胞中双过表达miR-27a和FOXO1,MTT和流式细胞仪分析结果显示:过表达FOXO1可以逆转过表达miR-27a诱导的OGD处理后海马神经元保护作用的细胞生物学效应。(10)Western blot检测结果显示:与正常对照组相比,氧糖剥夺处理后的海马神经元中cleaved caspase-3的表达显著增高(p<0.01);与阴性对照组(mimic control)相比,mi R-27a mimic转染组中海马神经元中cleaved caspase-3的表达明显降低(p<0.01)。结论1.成功制备大鼠海马神经元氧糖剥夺模型。2.经氧糖剥夺处理后的海马神经元中,miR-27a的表达水平下调,在海马神经元中过表达miR-27a,可以有效地减轻氧糖剥夺诱导的细胞活力的降低和其所诱导的细胞凋亡比例的增加,具有神经保护作用。3.FOXO1是miR-27a调控靶基因,miR-27a可以抑制FOXO1蛋白的表达。过表达FOXO1可以逆转过表达miR-27a诱导的OGD处理后海马神经元保护作用的细胞生物学效应。4.miR-27a通过抑制海马神经元中cleaved caspase-3的表达,发挥缺血缺氧保护作用。