雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.)属卫矛科双子叶木质藤本植物,又名断肠草、黄藤木等,主要分布于中国长江流域以南各地及西南地区。雷公藤作为一种传统中药,具有活血化瘀、消肿散结、杀虫止血等功效。雷公藤甲素来自于雷公藤植物组织,具有高度的效价,是雷公藤的主要有效成分之一。本研究以雷公藤悬浮细胞为材料,通过构建雷公藤细胞的固定化培养体系,并在此基础之上对雷公藤固定化细胞的生物学特征及甲素合成情况进行研究。主要内容如下:1.采用雷公藤固定化细胞作为材料,研究雷公藤固定化细胞生理指标及雷公藤甲素质量分数。利用海藻酸钠凝胶包埋法首次构建了雷公藤细胞固定化培养体系,研究了固定化细胞的生长及雷公藤甲素合成的变化情况。研究发现,固定化细胞经历了缓慢、指数及稳定三个生长阶段;固定化细胞培养液总糖、可溶性蛋白质及丙二醛的含量随着培养时间而逐渐减少;pH值则呈现先上升后下降的变化趋势:而细胞活力却呈现先下降后上升的趋势;培养过程中POD的变化呈现“V”字型;SOD酶活性变化不大;PAL酶活性先上升而后缓慢下降;雷公藤甲素的合成具有较好的同增效应,细胞内外的甲素含量都在培养的第15天达到了最大值。2.雷公藤内生真菌作为诱导子调控雷公藤固定化细胞,对固定化细胞内外甲素含量的影响,同时影响雷公藤甲素峰值产量出现时间。结果表明:在诱导子的调控下,固定化细胞内甲素峰值质量分数的影响规律为:NS-13培养液诱导子比NS-13菌丝体诱导子更有利于固定化细胞胞内甲素的合成,NS-13培养液诱导子添加时间越早,对于胞内甲素的合成促进越明显。调控下的固定化细胞胞外甲素峰值产量累积的规律为:NS-13培养液诱导子在第6d添加时更能促进固定化细胞胞外甲素产量,其值远远高于CK。3.对雷公藤固定化细胞和悬浮细胞进行前体饲喂,研究不同浓度柠檬酸、水杨酸和苯丙氨酸对于其生物学特征及产甲素过程的影响。结果表明,柠檬酸、水杨酸和苯丙氨酸对于悬浮细胞的生长有不同程度的促进作用,对于固定化细胞的生长却无明显促进作用。不同前体的不同浓度对固定化细胞与悬浮细胞胞内雷公藤甲素质量分数影响存在差异,柠檬酸、SA和Phe在适当浓度下都有促进固定化细胞胞内甲素合成的能力,而只有在以下三种浓度下,柠檬酸0.5mmol/l、SA0.5mmol/l和Phe0.01mmol/1时才对悬浮细胞胞内甲素合成有促进作用。不同前体的不同浓度对固定化细胞与悬浮细胞胞外雷公藤甲素质量分数影响存在差异,柠檬酸、SA和Phe在适当浓度下均能促进悬浮细胞向胞外释放次生代谢产物的能力,且有效促进悬浮细胞外甲素的积累。对比于悬浮细胞,这三种前体物只有在合适浓度下,才能够促进固定化细胞向胞外释放甲素。4.在雷公藤固定化细胞和悬浮细胞中添加抑制剂,研究细胞的生长及其胞内外甲素生物合成途径中抑制剂所产生的影响。添加不同浓度的三种抑制剂对雷公藤固定化细胞与悬浮细胞胞内甲素峰值质量分数影响为:单萜合成的代谢抑制剂(α-蒎烯、松油醇及樟脑)在质体DXP途径中,都能促进甲素的合成。α-蒎稀浓度越小,越能促进固定化细胞胞内甲素合成,但松油醇和樟脑则都是浓度越高,对固定化细胞内甲素合成作用越强。而对于促进悬浮细胞内甲素的合成,则需要适当浓度的抑制剂。不同浓度的三种抑制剂对固定化细胞和悬浮细胞外甲素峰值质量分数影响为:α-蒎稀和樟脑浓度越小,越能促进固定化细胞向胞外释放甲素,而松油醇浓度越高,越促进固定化细胞向胞外释放甲素。与固定化细胞不同,α-蒎稀、松油醇和樟脑都是浓度越高,越促进悬浮细胞向胞外释放甲素。