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牙髓和根尖周组织病变是口腔科常见的一类疾病,常表现为牙髓不可逆性的炎症以及根尖周组织的破坏,有时伴随剧烈的疼痛。目前临床上解决这一类疾病主要的手段是根管治疗,然而经过大锥度器械预备后的牙齿丧失了牙神经的营养和感觉功能,有可能出现根折,再感染等一系列并发症。随着组织工程的发展,牙髓再生是目前我们研究和探索的新方向。外泌体（exosome,Exo）是活细胞分泌的功能性的小囊泡,内含多种来源细胞的信号分子,包括m RNA、蛋白质等,靶细胞通过摄取这些携带信号分子的小囊泡,完成细胞间的信息传递和信号交流,从而发挥其来源细胞类似的生物学功能。外泌体作为组织工程的信号分子需要一定的载体,使其在局部能够缓慢释放从而发挥作用。有研究表明,明胶和纤维蛋白交联改性作为组织工程支架可以有效的促进关节软骨碎块化后软骨细胞的迁移、增殖、基质合成及组织融合,因此我们推测,纤维蛋白/明胶支架负载外泌体在牙髓组织工程中也可以发挥类似的作用。目的:采用纤维蛋白/明胶复合水凝胶支架材料负载牙髓干细胞来源外泌体（dental pulp stem cells-Exosome,DPSCs-Exo）,通过体外实验探究负载外泌体的水凝胶促进细胞迁移生长,体内实现异位根管内牙髓样组织再生的可能性,为牙髓组织工程发展提供参考。方法:1.收集新鲜拔除的人离体牙,从牙髓中提取人牙髓干细胞（dental pulp stem cells,DPSCs）,流式细胞术对表面抗原进行鉴定;采用超速离心法从牙髓干细胞培养上清液中分离提取外泌体,使用蛋白免疫印迹法（Western Blot,WB）、纳米颗粒跟踪分析（nanoparticle tracking analysis,NTA）及透射电镜对所提取外泌体进行鉴定。2.制备纤维蛋白/明胶复合水凝胶,记录不同凝血酶浓度下的结胶时间,选择最适浓度用于后续实验;水凝胶经临界点干燥后,扫描电镜观察其三维结构及分别负载牙髓干细胞和外泌体时的状态;在纤维蛋白/明胶复合水凝胶上负载细胞,在培养的第3天进行live/dead细胞活力实验,探索该支架材料的细胞相容性。3.将PKH26染色的外泌体与牙髓干细胞共培养,激光共聚焦显微镜观察细胞内摄外泌体情况;在纤维蛋白/明胶支架上负载外泌体和牙髓干细胞,live/dead细胞活力实验评估负载外泌体的纤维蛋白/明胶支架对细胞活力的影响;Transwell实验检测纤维蛋白/明胶支架负载外泌体后对细胞迁移的影响;实时定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,q PCR）检测纤维蛋白/明胶支架在有无负载外泌体时牙本质基质蛋白（dentin matrix protein 1,DMP1）,血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）,基质细胞衍生因子1（stromal cell derived factor 1,SDF1）,趋化因子受体4（chemokine receptors 4,CXCR4）等基因表达的差异;将含或不含外泌体的水凝胶注射到牙根段根管内并移植于免疫缺陷裸鼠背部皮下,8周后取出根管内软组织,切片苏木精伊红（hematoxylin and eosin,HE）染色观察组织构成差异。结果:1.从人离体牙中分离培养牙髓干细胞,流式细胞术结果显示CD73,CD90阳性表达,CD31,CD45,NESTIN阴性表达,符合牙髓干细胞特征。采用超速离心法成功分离提取人牙髓细胞来源外泌体,使用Western Blot对外泌体标志蛋白进行检测,与对照组相比,CD9,CD63均呈阳性表达;NTA粒径分析提示粒子分布在30-150nm,平均粒径为84.06nm;透射电镜观察到外泌体呈典型双侧膜状小囊泡,符合外泌体特征。2.按照不同成分（纤维蛋白酶原,凝血酶,明胶）浓度搭配制备纤维蛋白/明胶复合水凝胶,当纤维蛋白浓度为5mg/ml,明胶质量分数为4%,凝血酶浓度为0.5U/ml时,复合水凝胶6分钟左右结胶,符合实验需求;扫描电子显微镜结果显示该水凝胶三维微观呈疏松多孔的纤维网状结构并可以成功负载细胞和外泌体,细胞在支架上伸展黏附三维生长,外泌体呈圆球形粘附在支架材料表面;live/dead实验结果显示,纤维蛋白/明胶水凝胶有良好的细胞相容性,极小的细胞毒性,是组织工程支架材料的优良选择。3.染色示踪实验显示外泌体能在30分钟内被牙髓细胞摄取,进入细胞质分布在细胞核周围;live/dead实验表明在纤维蛋白/明胶水凝胶支架上负载牙髓干细胞来源外泌体对细胞的生长有正向促进作用（P<0.001）。Transwell实验表明纤维蛋白/明胶水凝胶负载外泌体可以有效促进细胞的迁移（P<0.0001）。q PCR结果显示负载外泌体的纤维蛋白/明胶支架上牙髓细胞VEGF,DMP1,CXCR4的表达量较对照组明显上升,SDF1表达下降（P<0.05）。表明牙髓干细胞来源外泌体可以在纤维蛋白/明胶三维环境下促进牙髓细胞成血管,成牙本质及促迁移等相关基因表达上升。在裸鼠背部皮下植入含或不含外泌体的纤维蛋白/明胶水凝胶材料的牙根段,8周后取材切片观察,两组均有类牙髓样软组织长入根管内,取出新生软组织HE染色,含外泌体组显示有更加丰富的富含红细胞的小血管结构。结论:负载牙髓干细胞外泌体的纤维蛋白/明胶复合水凝胶作为支架材料具有良好的生物相容性,能促进细胞迁移、并实现异位根管内组织新生,在牙髓组织工程中促进牙髓再生具有潜在的应用价值。