磷脂酶C（简称PLC）是一类可催化磷脂C<,3>磷脂酰键水解的水解酶。PLC主要存在于血小板内膜上，通过对膜磷脂如磷酯酰胆碱、磷酯酰肌醇、磷酯酰乙醇胺等的催化水解来影响细胞代谢和信息传递。动物实验证明，细菌产生的PLC具有抗凝血及延缓血小板聚集的作用，可预防血栓形成和心脑血管疾病。细菌产生的PLC通常分泌于胞外，产量低，分离纯化困难。本实验旨在将蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）产生的PLC由胞外酶转为胞内酶，并在胞内进行表达，以求解决以上问题。具体内容如下： 根据GenBank中编号143339的蜡样芽胞杆菌的磷脂酰胆碱磷脂酶C的基因序列，先后设计了四对引物对该基因进行了PCR扩增，均扩增出特异性很好的目的条带，切凝胶纯化回收后，引物I的PCR扩增产物选用BamHI和PstI两种限制性内切酶酶切，其他引物的PCR扩增产物选用BamH I和Xho I两种限制性内切酶酶切，酶切后均连接pMD18-T载体转入E.co1i TG1中。采用蓝白斑加氨苄青霉素进行筛选，选出的白斑分别进行PCR检测和双酶切检测，阳性克隆子进行测序。测序后序列均与143339序列进行比对，结果显示引物I克隆出长度为1623bp长度的基因片段，相似性很高，达94％，说明所得序列即为Bacillus cereus PLC基因序列的一部分；引物Ⅱ克隆出长度为1012bp长度的基因片段，相似性不高，仅为46％，中间发生了多个突变；引物Ⅲ克隆出长度为929bp长度的基因片段，相似性高达93％，但中间有一移码突变；引物Ⅳ克隆出长度为1020bp长度的基因片段，相似性很高，达94％。 引物Ⅰ克隆出的序列没有其适合表达的表达载体pMAL，所以只保留FG1的阳性克隆子，待以后有条件时采用；引物Ⅱ和Ⅲ克隆的序列中间或多或少都有突变，可能影响表达；因此最后采用引物Ⅳ扩增出的序列构建了阳性克隆子，再用BamHⅠ和XhoⅠ两种限制性内切酶酶切，连接pET28a构建表达载体pET-PLM，再转入E.coliBL21菌株中，通过鉴定确定序列已转入后，诱导表达，SDS-PAGE胶和卵黄琼脂杯碟法初步证明PLC已转入胞内。