背景:感染是肝移植术后最常见的并发症,亦是移植病人术后死亡的主要原因之一,包括病毒、细菌、真菌的感染。然而,在肝移植受者中大部分严重感染源自腹腔内细菌或真菌感染,而且发生率高,约为35%- 70%,半数患者感染发生在移植术后2周内。多项研究已证实病毒、真菌感染与免疫排斥密切相关,促进了排斥反应的发生。但是细菌感染与免疫排斥反应的关系这类研究鲜见报道。在临床实际治疗中,发生细菌感染的病人,免疫抑制药物的应用与抗感染治疗产生了矛盾,这时为抢救病人的生命,往往需要减量或停用免疫抑制药物,而这对移植肝脏的影响我们不得而知。但现有的研究指出:当发生重症感染时,机体为保护组织器官的过度病理性损害,激发免疫反应的同时,也可能启动了免疫抑制效应。在众多因素中,CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)的表达变化引起了广泛观注,它能够分泌免疫抑制因子IL-10和TGF-β,并通过这二种细胞因子发挥较强的免疫抑制效应;而且Treg细胞能够抑制免疫排斥反应和移植物抗宿主病(GVHD)的发生。基于以上国内外的研究成果,我们想到,临床病人在肝移植术后发生细菌感染的过程中机体的免疫反应是否被抑制?Treg细胞是否在这种变化中发生了增殖并对移植肝产生影响?探明这种变化必将加深对肝移植细菌感染与免疫排斥的认识,为我们的深入研究奠定基础,同时也有助于开展临床新的治疗策略。目的:一、建立大鼠肝移植腹腔细菌感染的模型,研究细菌感染对移植肝免疫排斥反应的影响;二、探讨细菌感染和免疫排斥反应双重因素作用下T淋巴细胞的增殖、功能的变化及Treg细胞的增殖情况和其生物学效应。方法、结果:第一部分大鼠肝移植术后细菌感染对移植肝免疫排斥反应的影响方法:1.细菌感染模型的建立:在改良的Kamada双袖套法的基础上,以近交系DA大鼠为供体,LEW大鼠为受体,建立肝移植排斥反应模型;以大肠杆菌为诱导菌,采用腹腔内活菌注射的方法建立移植后感染模型。术后随机分为2个注射时间点:术后3天和5天,并根据注射细菌浓度和用量的不同,每个时间点分为6组:5×10~5cfu/ml组,2×10~5cfu/ml组,2×10~6cfu/ml组,2×10~7cfu/ml组,2×10~8cfu/ml组和腹腔内生理盐水注射对照组。设菌液注射前1天,注射后1d、3d、5d、7d 5个时相点,每个时相点6只动物,另外设8只大鼠观察感染后一般情况和受体的存活时间。通过对大鼠的存活时间、直肠温度、ALT、TB、WBC计数、TCO2、HCO3-、PH等指标评定感染的严重程度。2.感染对免疫排斥反应的影响:以DA或LEW大鼠为供体,LEW大鼠为受体,建立肝移植感染模型,术后大鼠随机分为4组:同基因移植对照组G1组、同基因移植腹腔感染组G2、异基因移植对照组G3、异基因移植腹腔感染组G4。腹腔内细菌注射浓度为5×10~5cfu/ml。每组设感染前1d、感染后1d、3d、5d、7d 5个时相点,每个时相点6只。通过RT-PCR测定肝内CCR5、CCR3、MCP-1mRNA,CCR5、CCR3免疫组织化学染色和肝病理Banff评分评定免疫排斥反应。所有数据分析均通过SAS 6.0软件进行,采用双因素方差分析、t检验、秩和检验等方法,P<0.05判定为有统计学意义。结果:1.术后5天注射组最长生存时间为感染后5天,不利于后续研究,故舍去;2或5×10~5cfu/ml这二个浓度在术后3天注射时,最长生存时间分别为术后11天(感染后8天)、术后14天(感染后11天),感染后7天生存率分别为37.5%和100%。相应生化指标检测发现,2×10~5cfu/ml组在感染后5天相应指标逐渐正常,腹腔细菌培养阴性,故推断腹腔感染可自行抵抗,达不到研究目标;5×10~5cfu/ml组随着病情的发展,大鼠出现体温升高、酸碱平衡紊乱、WBC增加、ALT、TB持续上升等变化,与非感染组比较差异显著;组织器官病理切片显示,肾脏和肺脏没有明显的病理学改变。2. G4组CCR5mRNA的表达逐渐下降,CCR3和MCP-1mRNA的表达则逐渐升高,术后8天(感染后5天)各指标与G2、G3组均有明显的统计学意义(P<0.01);肝病理Banff评分显示,G4组肝实质损害加重,但免疫排斥反应减轻,与G3组比差异有显著性(P<0.05)。第二部分大鼠肝移植术后细菌感染对Treg、T淋巴细胞增殖、功能及分化的影响方法:动物分组同前:同基因移植对照组G1组、同基因移植腹腔感染组G2、异基因移植对照组G3、异基因移植腹腔感染组G4。分别采用流式细胞术、单向混合淋巴细胞培养(MLC)、RT-PCR技术对外周血T淋巴细胞亚群、功能、肝脏内IL-2、IL-6、IL-10、IL-4、IFN-γ、TNF-α、TGF-βmRNA的表达进行测定,观察感染对T淋巴细胞功能和分化的影响。同时采用流式细胞术及RT-PCR技术对脾脏内Treg细胞的增殖和Foxp3mRNA的表达测定。结果:1.异基因移植感染组G4淋巴细胞数量持续下降,比例失调,CD4+/CD8+比值降低,该比值在感染后各时间点与异基因移植组G3比较均有明显的统计学意义(P<0.01);混合淋巴细胞培养结果显示:G4淋巴细胞功能持续上升,但上升速度和幅度均低于G3组,感染后3天与之比较各时间点均有明显的统计学意义;G2组淋巴细胞功通通虽然也呈现上升的趋势,但升高不及G4组,与之比较感染前后各时间点均有差异;2.肝脏内细胞因子mRNA表达测定显示:G3组各种因子mRNA的表达均升高;G4组IL-4、IL-10、TGF-βmRNA的表达水平持续增加,但三者表达水平不完全一致,后二者的表达量远高于前者;IL-2、IL-6mRNA表达水平则先升后降;G3组上述因子的mRNA表达恰恰相反,前三种下降,后二种上升,感染后5天各指标与G3组比较均有意义,IFN-γ、TNF-αmRNA的表达则持续下降,与G2、G3组比较自感染后各时间点比较均有统计学意义;3. G1、G2、G3组Treg细胞在术后或感染后增殖不显著,各时间点及各组比较均无意义;G4组Treg细胞显著增殖,尤其是感染后5天,与其它各组及组内比较均有差异。G4组Foxp3 mRNA的表达水平不及Treg显著,但与G3组比较有统计学意义。第三部分Treg细胞在移植后感染免疫紊乱中的作用方法:以DA大鼠为供体,LEW大鼠为受体,术后分为4组:急性排斥组G1、移植后腹腔感染组G2、G3组:在第三组处理的基础上于术后第2天始加用anti-IL-10和anti-TGF-β单克隆抗体,注射量分别为:1.2mg/kg/d和0.9mg/kg/d,G4组:在第三组处理的基础上于术后第2天开始加用anti- CD25单克隆抗体,注射量为:1.0mg/kg/d。每组设感染前1d、感染后1d、3d、5d、7d 5个时相点,每个时相点6只动物。分别采用流式细胞术、单向混合淋巴细胞培养、RT-PCR技术对外周血淋巴细胞亚群、淋巴细胞功能、肝脏内IL-4、IFN-γ、IL-10、TGF-βmRNA测定;并对肝脏内CCR5、CCR3mRNA的表达和肝脏病理Banff评分进行评估,以判定肝脏的免疫排斥反应。结果:G3、G4组T淋巴细胞数量持续下降,但CD4+/CD8+比值上升,G3的这种变化略显著,感染后5天,G3组上升幅度高于G2组,二组相比有统计学意义,并在感染后5、7天与G1、G2组比较有差异;G3、G4组淋巴细胞功能得到部分恢复,与G2组比较在感染后5天有差异,与G1组比较,自感染后3天有差异。同样地,G3组的上升幅度高于G4组,二组在感染后3天有统计学意义;G3、G4组IL-4、IFN-γmRNA的表达显著升高,与G2组比较,感染后即有显著的统计学意义;G3、G4组CCR3、CCR5mRNA的表达与G2组比较均增加,感染后5天、7天与之比较各指标均有统计学意义;肝脏病理Banff评分显示,G3、G4组的免疫排斥反应部分恢复。结论:1.以DA大鼠为供体,LEW大鼠为受体采用腹腔内大肠杆菌注射的方法制作感染模型,是进行肝移植术后细菌感染研究的理想动物模型。该模型具有良好的可重复性和可靠性,不伴有多器官的损害,受损因素单一,有利于目的研究;2.细菌感染与免疫排斥反应的协同作用降低了CCR5mRNA的表达,增加了CCR3和MCP-1mRNA的表达,从而使免疫排斥反应部分受到抑制;3.细菌感染和免疫排斥反应均能增加淋巴细胞的功能,但二者的同时作用使淋巴细胞功能下降,CD4+/CD8+比值降低,促进Th2细胞的分化;4.肝移植术后细菌感染促进了Treg细胞的增殖和Foxp3mRNA的表达,但只有部分发生增殖的Treg细胞能表达Foxp3mRNA;5.抑制Treg细胞的增殖或阻断IL-10和TGF-β的作用,可促进Th2细胞的分化,部分恢复淋巴细胞的功能和免疫排斥反应,Treg细胞不是唯一的抑制因素。