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妊娠早期,随着滋养层细胞的入侵,子宫内膜在雌激素和孕激素的作用下转化为蜕膜组织,支持胚胎着床和胎盘生长,进而形成母体和胎儿相互作用的母胎界面。免疫细胞约占母胎界面蜕膜组织细胞的40%,其中自然杀伤细胞（natural killer cells,NKs）大量存在,占免疫细胞的比例高达70%。这些蜕膜NK细胞（decidual NK cells,dNKs）具有独特的表型与功能特征,如呈现CD56brightCD16-的表型特征,高表达组织居留NK细胞标志分子CD49a,且具有较强的分泌功能和较低的杀伤活性。母胎界面NK细胞参与维持胚胎免疫耐受,促进螺旋动脉重建,维持滋养层细胞侵袭,并促进胎盘和胎儿的发育。母胎界面dNK细胞的数量和功能异常,会打破母胎微环境的平衡,最终导致病理性妊娠的发生。复发性流产（recurrent spontaneous abortion,RSA）与反复移植失败（recurrent implantationfailure,RIF）引发原因众多,部分原因尚不明确,缺乏可靠的筛查指标和有效的治疗手段。目前已成为一种困扰育龄女性的常见妊娠疾病,严重影响生殖健康。二者通常被认为致病机理相似,与母胎界面dNK细胞的异常相关。已有研究表明,在不明原因复发性流产病人的蜕膜组织中,CD49a+NK细胞显著减少,且分泌生长促进因子（growth promoting factors,GPFs）的功能受限。给生育障碍的NK细胞缺陷鼠过继转输CD49a+蜕膜样NK细胞可有效改善小鼠妊娠结局。然而,目前尚未有人蜕膜样NK细胞在妊娠疾病治疗中的相关报道或专利。因此,本研究旨在建立人CD49a+诱导蜕膜样NK细胞（induced decidual-like NK cells,iNKs）的体外培养体系,通过宫腔灌注等手段辅助治疗适龄女性复发性流产与反复移植失败等妊娠疾病,为治愈不孕不育提供新思路、新方法。获得如下结果:1.体外诱导扩增获得具有增殖潜力的CD49a+iNK细胞:我们成功建立起3种细胞来源的iNK细胞体外培养体系。CB-iNK细胞来源于脐带血造血干细胞（hematopoietic stem cells,HSCs）;BM-iNK细胞来源于骨髓 HSCs;pNK-iNK 细胞来源于外周血 NK 细胞（peripheral blood NK cells,pNKs）。诱导培养体系基于细胞因子组合且不含饲养细胞。iNK细胞高表达组织居留分子CD49a且具有一定的增殖潜力。2.iNK细胞与dNK细胞基因表达谱相似:我们分选了 pNK细胞、dNK细胞、CB-iNK细胞、BM-iNK细胞以及pNK-iNK细胞,对其进行转录组测序分析。通过对不同组NK细胞进行差异基因分析及聚类,我们发现iNK细胞与dNK细胞基因表达谱具有一定的相似性。3.iNK细胞与dNK细胞表型相似:通过分析转录组测序数据以及使用流式细胞术对细胞表面分子进行检测,我们发现CB-iNK细胞、BM-iNK细胞以及pNK-iNK细胞表达dNK细胞特征性表型分子,如CD9、CD151、CD103等。4.iNK细胞杀伤活性低:为了评估iNK细胞临床应用的安全性,我们对iNK细胞的杀伤活性进行了检测。对转录组测序数据进行基因集富集分析,结果显示:“NK细胞介导的细胞毒性”信号通路中的相关基因在pNK组更富集。表达量热图及流式细胞术检测结果均提示,iNK细胞与dNK细胞均下调表达“NK细胞介导的细胞毒性”信号通路中的相关基因,如FCGR3A（CD16）。杀伤实验的结果表明,iNK细胞和dNK细胞对K562细胞的杀伤效率显著低于pNK细胞。以上结果均提示:iNK细胞具有较低的杀伤活性。5.iNK细胞呈现dNK细胞功能特征:iNK细胞与dNK细胞均包含高比例的CD49a+EOMES+细胞亚群。通过流式细胞术及免疫荧光检测,我们发现iNK细胞与dNK细胞具有分泌GPFs的功能。对转录组测序结果的分析发现,iNK细胞与dNK细胞高表达促进血管生成相关基因,并高表达组织居留相关的趋化因子及趋化因子受体。以上结果提示,iNK细胞呈现与dNK细胞相似的功能特征。6.iNK细胞促进胎鼠的生长发育:由于dNK细胞功能相关分子在人类与小鼠物种之间具有较高的相似性,因此我们将iNK细胞过继转输给重症联合免疫缺陷鼠（NCG小鼠）,在动物模型体内验证iNK细胞的生理功能。通过对孕鼠进行多普勒超声检测以及对胎鼠和胎盘进行测量,我们发现过继转输iNK细胞可以有效促进母胎界面血管发育以及胎盘和胎鼠的生长。7.复发性流产患者月经血NK（menstrual blood NK,MBNK）细胞免疫状态异常:我们通过流式细胞术对MBNK细胞进行检测,发现RSA患者月经血CD45+淋巴细胞中NK细胞所占比例明显低于正常对照女性。通过对转录组测序数据进行生物信息学分析发现,RSA患者和正常人MBNK细胞存在明显差异,而pNK细胞则未显示出这种差异;正常人MBNK细胞与dNK细胞存在很高的相似性。RSA患者MBNK细胞组织居留分子及抑制性受体表达下降,细胞毒性相关分子表达上升,总体呈现一种免疫异常状态,提示可通过对患者MBNK细胞进行检测以筛选合适的患者入组临床试验。8.建立自体蜕膜样NK细胞临床研究方案:为推进iNK细胞的临床应用,我们建立了针对性的临床试验方案,包括研究目的、研究对象、研究方法与技术路线、疗效评价以及研究的质量控制与质量保证等。综上所述,我们建立了三种体外诱导扩增人CD49a+蜕膜样NK细胞的体系。依赖多种细胞因子组合获取的iNK细胞具有dNK细胞的表型和功能特征,可以有效促进胚胎的生长发育。在此基础上,检测RSA患者MBNK细胞为后期临床试验的进行提供可靠的受试者筛查及评价体系。推进iNK细胞的临床应用研究将有助于解决育龄女性的妊娠障碍,降低患者及其家庭的经济负担与精神压力,促进社会和谐稳定发展。