目的:癫痫（Epilepsy,EP）是一种因大脑神经元异常放电所引起的短暂的大脑功能失常的脑部疾病,癫痫疾病的发病原因很多,大量研究证明离子通道基因突变是特发性癫痫和难治性癫痫发生重要原因。自闭症,全称自闭症谱系障碍（autism spectrum disorders,ASD）,是一种广泛神经发育障碍,致病因素较为广泛,遗传学上一般认为染色体异常和基因突变导致的。癫痫共患自闭症谱系障碍疾病是一种常见的神经系统疾病,往往具有家族遗传性。癫痫共自闭症疾病的表达基因SCN1A和SCN2A位于常染色体2q24上。SCN2A编码的Na V1.2是电压门控性钠离子通道（Voltage-gated Sodium Channels,VGSC）亚型之一。Na_V1.2大量存在于中枢神经系统中,包括成熟神经元的轴突无髓鞘神经束、轴突起始段和郎氏结,起着诱发动作电位和传播动作电位兴奋神经元的重要作用。钙调蛋白（Calmodulin,CaM）是体内重要的钙离子结合蛋白,调节细胞内钙离子浓度,参与多种生物学调控途径。从结构而言,它是由两个高度同源的球状区域,即C-lobe和N-lobe,以及连接两个lobe的呈α-螺旋的linker组成,空间结构上呈哑铃状。每个lobe都包含两个Ca2+结合位点（又称EF-hand）,而每个EF-hand结构均能结合一个Ca2+,但C-lobe和N-lobe的Ca2+结合能力却有各不相同,已有研究表明,C-lobe与Ca2+的亲和力较N-lobe高约5-10倍。部分电压依赖性钙离子通道亚型和电压门控性钠离子通道亚型的C-terminal上具有一段可以与CaM特异性结合的经典序列,异亮氨酸-谷氨酸序列被命名为IQ（Isoleucine-Glutamine）基序。已有的研究证明,CaM可以与NaV1.1 IQ结合,调节VGSCs离子活动,但到目前为止,CaM与Na_V1.2相互作用结合机制及结构特异性结合方式尚不明确。本实验研究CaM与Na_V1.2上的功能特异性氨基酸序列—IQ基序间的相互作用,以其明确CaM与Na_V1.2具体结合作用机制,为离子通道疾病如癫痫、自闭症等疾病发生机制阐明奠定一定的理论和实践基础。研究方法:1.cDNA构建以人类Na V1.2的cDNA序列作为模板,通过PCR技术制作对应的Na_V1.2 IQ基序（IQ,Isoleucine-glutamine motif）,引物由VectorNTI软件设计完成。人源CaM及其截短蛋白N-lobe（a.a.2-80）和C-lobe（a.a.76-148）由HEK293T细胞的cDNA克隆而来。将上述三种DNA分别插入到pGEX-6P-1 H320载体中表达纯化。2.原代海马神经元培养取出生三天内的新生Wistar大鼠幼鼠麻醉断头,即刻取出大脑放入4℃的Hank’s液中浸泡。显微镜下冰浴状态解剖取出海马,将其用冷藏的细胞培养液（DME/F-12）冲洗。37℃,胰酶消化海马组织10分钟,消化完成后将其与自配海马神经元培养液均匀混合接种到培养皿上。第二天以后每隔24小时,原培养液体积半数更换神经元培养液。一周内密切观察神经元生长状态。3.蛋白的表达和纯化将构建好的四种载体转化到大肠杆菌BL21（DE3）中靶向表达蛋白。取保留菌种和氨苄青霉素（AMP）各300μL加入到400 mL1×LB培养液中,37℃水浴、125r/min震荡摇晃14小时,一般过夜即可。次日,紫外分光光度计测量得OD600在0.8-1.0之间,向培养菌液中加入1 mM异丙基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷（IPTG）和50 mg/mL AMP各300μL,恒温水浴孵育四小时后,将菌液分装入若干个50mL离心管中,离心弃去上清液,使用预冷PBS缓冲液重悬菌体沉淀,在冰浴状态下,超声技术裂解细菌,获取IQ基序。CaM及其截短蛋白蛋白菌液超声结束后,与谷胱甘肽-S-转移酶（GST）融合蛋白和谷胱甘肽琼脂糖4B珠蛋白（GS-4B）孵育纯化。使用PreScission Protease进行GST区域的酶切得到提纯的CaM或其截短蛋白。使用BSA蛋白质定量试剂盒通过浓度-密度校准曲线计算纯化后CaM或其截短蛋白的蛋白浓度,所得蛋白皆-80℃保存。4.分子对接技术使用Discovery Studio 2017软件的同源模型构建工具导出Na_V1.2 IQ的3D构型和CaM及其截短蛋白（N-lobe、C-lobe）。我们利用Discovery Studio软件中Dock Proteins协议的ZDOCK协议和RDOCK协议模拟细化得出能量最低的最佳对接方式。每个分子对接结果中实心带代表分子结构。5.双标记免疫荧光技术原代神经元爬片固定,Triton X-100穿孔,5%BSA封闭液封闭。分别与30倍稀释的兔抗Na_V1.2,和100倍稀释的小鼠抗CaM一抗,4℃下湿盒孵育过夜。PBS冲洗后与100倍稀释FITC荧光二抗（抗兔IgG）和TRITC标记二抗（小鼠IgG二抗200倍稀释）室温下孵育1小时。甘油封片,荧光显微镜镜下拍摄两种蛋白共定位表达情况。阴性对照与上述相同不加一抗。6.GST Pull-Down技术检测的相互作用GST融合IQ固定在GS-4B上与CaM在[Ca²⁺]Tris缓冲液中孵育,四小时后用对应钙离子浓度的Tris-Buffer溶液清洗两次,结束孵育。孵育后的GST-IQ与CaM蛋白复合物内加入SDS上样缓冲液,加热变性。骤冷离心后取上清液加入到15%的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离。电泳结束后使用考马斯亮蓝R（CBB）染色,脱色后使用Photoshop软件数字化蛋白条带,再经ImageJ软件定量灰度值;校正后转换成蛋白质摩尔量进行统计分析。7.免疫印迹实验法孵育后的GST-IQ与CaM蛋白复合物内加入15μLSDS上样缓冲液,加热变性,骤冷离心后取上清液进行电泳分离。电泳结束后制转膜三明治,避光湿转,封闭2小时,孵育一抗为800倍稀释的鼠源抗CaM抗体4℃过夜,TBST洗三次共十分钟,孵育HRP山羊抗兔IgG二抗（1:5000）,TBST洗三次10 min。ECL发光液1:1混合,进行发光。8.数据分析SigmaPlot12.2软件绘制拟合曲线。Hill方程一点拟合模型Y=B_max·X/（K_d+X）;两点拟合模型Y=Bmax1·X/（Kd1+X）+Bmax2·X/（Kd2+X）。Bmax表示最大结合量,Kd为表观解离常数。使用SPSS软件单因素方差分析分析实验数据,P<0.05认为具有统计学差异。数据用平均值±标准误（n=4）表示。结果:1、本实验成功构建CaM及其截短蛋白（N-lobe、C-lobe）和Na _V1.2 IQ质粒,并且成功的将其分离纯化为CaM蛋白、N-lobe蛋白、C-lobe蛋白和Na_V1.2 IQ基序。2、本实验成功检测到Na_V1.2与CaM在海马神经元中共定位表达。3、分子对接结果参数如下:（1）CaM与Na_V1.2的结合参数:ZDock14.62,E＿RDock-57.18 kJ/mol（2）N-lobe与Na_V1.2的结合参数:ZDock13.02,E＿RDock-47.16 kJ/mol（3）C-lobe与Na_V1.2的结合参数:ZDock12.44,E＿RDock-49.17kJ/mol。4、Ca2+/CaM与Na _V1.2 IQ的结合量随钙离子浓度和CaM浓度升高而升高。5、apo CaM(Ca²⁺free form calmodulin)与Nav1.2 IQ的结合量明显高于Ca²⁺/CaM与Na _V1.2 IQ。6、CaM的C-lobe与Na _V1.2 IQ在[Ca²⁺]≈free条件下的结合量明显高于其他有钙离子浓度下与Na V1.2 IQ的结合量,[Ca2+]为100 nM时结合量最低;CaM的N-lobe与Na_V1.2 IQ在[Ca2+]为500 nM条件下的结合量明显高于其他钙离子浓度下与Na_V1.2 IQ的结合量,[Ca2+]为2 mM条件下结合量最低。四种钙离子浓度下([Ca²⁺]≈free、100 nM、500 nM和2 mM),CaM的C-lobe与Na_V1.2 IQ的Bmax均大于N-lobe与Na_V1.2 IQ的Bmax。结论:1、CaM可以与Na_V1.2 IQ结合。2、CaM与Na_V1.2 IQ的结合自由能最小,分数最高,是最稳定的结合形式。3、Ca2+/CaM与Na V1.2 IQ结合具有CaM浓度依赖性和钙离子浓度依赖性。4、Apo CaM(Ca²⁺free form calmodulin)对通道有的亲和力比Ca²⁺/CaM对通道的亲和力高,优于Ca2+/CaM与Na V1.2 IQ结合。5、C-lobe对通道的亲和力高于N-lobe对通道的亲和力,是CaM与通道结合的主要功能区域。本研究揭示了钙离子、CaM和Na_V1.2间的作用机制,阐明了CaM调节Na_V1.2通道的主要结构区域,为癫痫共患自闭症谱系障碍疾病等离子通道疾病提供了研究方向,为CaM和VGSCs相关的药物作用靶向研究的探索提供实验依据,为深入研究离子通道基因突变引起的疾病发生机制提供理论基础。