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研究目的:本研究旨在将体外原代培养的人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs)接种于浓缩生长因子(concentrated growth factors,CGF)纤维蛋白膜上,以临床较普遍应用的海奥生物膜作为对照,观察hPDLSCs在两种膜表面增殖以及成骨分化的情况,从而为骨组织工程构建一种新型移植物提供理论依据。研究方法:1.hPDLSCs体外分离培养与鉴定通过酶消化法对hPDLSCs进行原代培养,有限稀释法克隆化培养纯化细胞;利用流式细胞仪检测细胞表面间充质干细胞抗原标志物的表达;在体外成骨、成脂肪、成软骨条件下对hPDLSCs进行诱导,检测其多向分化潜能;进行hPDLSCs的传代,收集第3代细胞用于后续实验。2.CGF制备与结构特点分析:利用特殊Vacuette真空采血管抽取患者静脉血9ml,置入配套Medifuge离心机差速离心。弃除上部血清层与底部红细胞层,将中间CGF纤维蛋白层凝胶压制成膜,HE法检测其组织结构,ELISA法分析内部生长因子释放特点。3.实验分组与细胞接种(1)实验分组:CGF膜组、海奥膜组及空白组。(2)接种培养:取生长状态良好的第3代hPDLSCs,消化离心后成特定密度的单细胞悬液,分别接种于CGF膜表面、海奥膜疏松层表面、空白24孔板中。4.贴壁检测:接种5天后,于光学显微镜下观察、拍照。5.细胞接种培养1、3、5、7天后,应用CCK-8法绘制细胞生长曲线,检测三组不同条件对hPDLSCs增殖活性的影响。6.成骨诱导7天后应用实时定量PCR及Western-Blot法对hPDLSCs进行成骨相关mRNA及成骨相关蛋白表达量的检测,研究其成骨能力的变化。研究结果:1.本实验成功应用酶消化法在体外分离培养hPDLSCs,所筛选细胞在形态上符合成纤维样细胞特点;诱导条件下可向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞方向分化,符合干细胞的特征;流式细胞仪检测结果显示人间充质干细胞表面阳性标记物(CD73,CD90,CD105,CD44)在hPDLSCs表面呈现高表达,阴性标记物(CD11b,CD19,CD34,CD45,HLA-DR)在 hPDLSCs 表面无表达。2.静脉血经差速离心后分三层,中间凝胶状物质即为CGF,压制成膜后,HE染色见其主要由纤维蛋白网格构成,内嵌合大量白细胞与血小板,底部有薄层红细胞;ELISA检测结果显示其主要生长因子TGFβ-1、PDGF-BB与IGF-1虽释放规律不同,但均可长效释放。3.贴壁检测结果显示:光学显微镜下可见hPDLSCs由CGF膜表面顺延爬出,细胞长轴与CGF表面基本垂直,以膜为中心呈现放射性生长,膜周边细胞呈梭形,排列紧密,垂直附着于CGF膜表面,使其呈固定状态,不随培养基漂移;海奥膜膜外细胞生长相对无序,细胞呈梭形,排列稀疏,板底细胞与海奥膜间未发生附着关系。4.CCK-8结果显示:同海奥膜组与空白组相比,膜培养1、3、5及7天后CGF膜组细胞数量均明显升高,差异有统计学意义;但第1-3天,海奥膜组与空白组细胞增殖活性无明显统计学意义,第3-5天海奥膜组细胞数量高于空白组(P<0.05),第5-7天时空白组细胞数量高于海奥膜组(P<0.05)。5.RT-PCR结果显示:三组细胞均在成骨条件下诱导7天后,CGF膜组的成骨相关基因ALP、Col-I、OPN、Runx-2的mRNA表达均高于其它两组(P<0.05),海奥膜组次之,空白组即基础成骨诱导液组最低,各组间两两比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。6.Western-Blot结果显示:三组细胞均在成骨条件下诱导7天后,CGF膜组的成骨相关蛋白ALP、Col-I、OPN、Runx-2的蛋白表达均高于其它两组,海奥膜组次之,空白组即基础成骨诱导液组最低,与RT-PCR结果吻合。结论:1.hPDLSCs具有较强的增殖能力,表达间充质干细胞表面特征,且在诱导条件下具有多向分化潜能,可作为组织工程种子细胞的重要来源。2.CGF能够为种子细胞提供良好支架与富含生长因子的微环境,从而更好的调控种子细胞的生长及分化,是组织工程领域中良好的潜在生物支架。3.hPDLSCs可于CGF膜上良好定植;CGF在体外对hPDLSCs的增殖具有明显促进作用,在与成骨诱导条件联合应用时,可显著促进其成骨分化能力。二者联合应用以构建新型复合物,有望修复骨组织缺损。